ELISPOT標準化的建立

為了實(shí)現ELISPOT的標準化，顯色最好在恒溫箱內進(jìn)行，溫度控制在25°C±5°C，顯色25分鐘為宜。另外，在37°C顯色也是不錯的一個(gè)方法，但要注意相應的縮短顯色時(shí)間到12-18分鐘，并且顯色中勤檢查。為了提高ELISPOT檢測結果的可重復性，增加實(shí)驗的可信度，必須建立一套標準化的實(shí)驗操作規范。標準化的實(shí)驗操作規范不僅僅是一些實(shí)驗操作，更是一個(gè)系統工程，需要提升到實(shí)驗室管理與制度架構上來(lái)建設。這包括實(shí)驗室制度的建立，實(shí)驗人員的培訓，實(shí)驗程序的建立和標準化，實(shí)驗設備、試劑、耗材的選擇與標準化等等。單就實(shí)驗流程而言，標準化規范從實(shí)驗樣品的采集階段就開(kāi)始了，一直延續到整個(gè)實(shí)驗的結束，即數據分析處理的完成。參見(jiàn)圖1。

如右圖所示，影響到ELISPOT斑點(diǎn)頻率的因素很多，我們來(lái)逐一分析。

細胞類(lèi)型
通常我們用來(lái)做ELISPOT檢測的細胞有血液來(lái)源的PBMC和脾臟來(lái)源的淋巴細胞。也有的實(shí)驗者需要用到骨髓細胞。來(lái)源不同，細胞的組成就有差別，所以要考慮到這些差別，不能直接作比較。是哪些因素導致了細胞來(lái)源不同，ELISPOT結果就不同呢？

一個(gè)因素是陽(yáng)性細胞在生物體內的分布。我們知道，細胞免疫往往發(fā)生在局部的免疫反應部位。比如發(fā)生粘膜免疫時(shí)，各種免疫細胞就會(huì )富集在粘膜器官；發(fā)生自身免疫反應時(shí)，致敏細胞也往往集中在受累器官。所以，局部器官的淋巴細胞中陽(yáng)性細胞的比例與血液或者脾臟中陽(yáng)性細胞占淋巴細胞的比例可能是不相同的。血液與脾臟之間也可能有差別。

另一個(gè)因素是APC的含量。不同組織器官來(lái)源，甚至不同的分離方法，在淋巴細胞中混合的APC細胞含量也有差異。極端情況（比如待測細胞是經(jīng)過(guò)磁珠純化的）APC含量不足，需要添加APC（人工培養的DC細胞或者“飼養細胞”）。這方面的詳細情況參見(jiàn)第四節。 
所以，標準化必須考慮細胞類(lèi)型和細胞組成。

細胞狀態(tài)
細胞狀態(tài)是體現實(shí)驗者技術(shù)水平與經(jīng)驗實(shí)力的試金石。很多實(shí)驗者問(wèn)我，為什么有些人的ELISPOT結果做得非常好，而另外有些人的結果卻做得非常糟。略去客觀(guān)因素不談，主觀(guān)因素主要體現在對檢測細胞的處理上。有些人有長(cháng)期養細胞和做細胞學(xué)實(shí)驗的基礎，處理細胞來(lái)得心應手，獲得的細胞狀態(tài)好，活力高，ELISPOT檢測的結果自然就好。反之，有些細胞還沒(méi)拿去做ELISPOT檢測之前，已經(jīng)被折騰得死去大半或者奄奄一息了，這樣能做出好的實(shí)驗結果來(lái)嗎？！

細胞狀態(tài)涉及到細胞來(lái)源（包括組織取樣）、細胞分離的方法、以及細胞是否需要凍存復蘇等諸方面。關(guān)于保持良好細胞狀態(tài)的內容參見(jiàn)第四節；關(guān)于細胞分離方法的內容參見(jiàn)第六節；關(guān)于細胞凍存復蘇方面的內容參見(jiàn)第七節。

這些環(huán)節都要做到標準化，細胞狀態(tài)才有保證，實(shí)驗結果的重復性與可信度才有保證。

細胞計數
細胞計數看起來(lái)很簡(jiǎn)單，很多實(shí)驗者都忽視它。但是它對ELISPOT結果可信度與重復性的影響是怎么強調也不過(guò)分的。因為ELISPOT檢測的是細胞頻率，分子式斑點(diǎn)的數目，分母是細胞的數目。如果經(jīng)過(guò)千辛萬(wàn)苦，我們把分子（也就是斑點(diǎn)）弄得很漂亮，也弄得很準確，但是分母卻給忽略了，那這個(gè)分數值（陽(yáng)性細胞頻率）能準確嗎？

我們達科為對此有刻骨銘心的感受。我們公司在05-06年曾經(jīng)有一個(gè)ELISPOT研究項目，就是研究相同的凍存細胞與刺激物在不同的實(shí)驗室是否能做出相同的結果。我們下了很大的功夫去研究細胞的凍存、復蘇，研究?jì)龃婕毎趪鴥鹊拈L(cháng)途運輸，也下了很大功夫去培訓參與實(shí)驗的各個(gè)實(shí)驗室的人員技術(shù)與資質(zhì)。最后做出來(lái)的實(shí)驗結果單從斑點(diǎn)與背景上來(lái)看無(wú)可挑剔，但是有兩個(gè)實(shí)驗室的數據與其它八個(gè)實(shí)驗室的數據有較大差異。最后經(jīng)過(guò)詳細的排查，原因竟然出現在血球計數板上！這兩家實(shí)驗室的血球計數板質(zhì)量差，誤差大，導致最后細胞計數誤差竟然達到±40%！

細胞計數最常見(jiàn)的裝備是血球計數板，雖看看起來(lái)不是什么高、精、尖設備，但是也代表了一個(gè)國家玻璃精加工的水平。我國能夠研制精密的大功率固體激光器，也有水平做出高質(zhì)量的血球計數板?？上У氖怯心芰Σ灰欢ㄓ性竿?，目前國產(chǎn)的各種血球其數板經(jīng)過(guò)測試都存在較大的誤差。建議還是購買(mǎi)進(jìn)口的血球計數板，確實(shí)好用。如果一定要用國產(chǎn)的，那請堅持使用同一塊血球計數板。

細胞稀釋也必須認真仔細，取樣之前注意混勻。做重要實(shí)驗的時(shí)候，最好讓兩個(gè)人獨立稀釋和計數，結果相差要控制到10%以?xún)取?

刺激物、試劑盒與血清
實(shí)驗要取得重復性，刺激物的刺激效果必須要可重復、可再現。一批刺激物用完之后，換下一批刺激物的時(shí)候，要做驗證性試驗。另外，有些多肽、蛋白類(lèi)的刺激物可能在保存的過(guò)程中會(huì )失活、降解，反復凍融也會(huì )造成問(wèn)題。這就要求預先擬定好刺激物的保存計劃，時(shí)隔三個(gè)月或者半年就要做一次驗證性的實(shí)驗。相關(guān)內容參見(jiàn)第四節。

目前市場(chǎng)上的ELISPOT試劑盒都是來(lái)自國際知名的公司，不同公司的試劑盒采用的抗體質(zhì)量都是有保證的。但是大家往往忽略了抗體之外的其他成分，比如封閉液、抗體稀釋液等等。這些也輔助試劑會(huì )造成顯著(zhù)的差別。在追求實(shí)驗結果的重復性與可信度的時(shí)候，必須引起重視。

血清與內毒素當然是一個(gè)重要影響因素，為了實(shí)現ELISPOT標準化，提高實(shí)驗的可信度與重復性，根本之道是采用無(wú)血清ELISPOT技術(shù)。相關(guān)內容參見(jiàn)第三節和第五節。

實(shí)驗操作流程與斑點(diǎn)顯色
本手冊的第三節就是ELISPOT標準化的操作流程，只要遵照執行，應該沒(méi)有什么問(wèn)題。但是有一點(diǎn)需要引起重視，那就是標準化同時(shí)也是固定化。往往一個(gè)實(shí)驗操作步驟有很大的彈性空間，可以這樣做也可以那樣做。如果較真起來(lái)，這些做法都有像它的道理，理論與實(shí)驗也不能證明誰(shuí)比誰(shuí)更優(yōu)。這才是他們得以同時(shí)保留下來(lái)的原因。但是一旦實(shí)驗室的操作方法固定下來(lái)，就不要隨意更改，即便是“等效”的操作也不要隨意變化。標準化其實(shí)也是固定化。只要標準操作方案沒(méi)有錯誤，就要嚴格執行。

斑點(diǎn)顯色之所以從實(shí)驗流程中單列出來(lái)，是因為它的重要性。目前ELISPOT有三套顯色系統，一套是PVDF膜上的HRP/AEC顯色系統，顯紅色的斑點(diǎn)；一套是PVDF膜上的AP/BCIP·NBT顯色系統，顯藍色的斑點(diǎn)；一套是透明板上的GABA/銀染系統，顯黑色的斑點(diǎn)。應該說(shuō)這些顯色系統之間的靈敏度與背景控制都沒(méi)有顯著(zhù)的差別，但是一旦選定一種顯色系統之后，最好長(cháng)期堅持，以滿(mǎn)足標準化的需要。 
顯色問(wèn)題除了顯色系統的選擇之外，還要注意顯色溫度與顯色時(shí)間。顯色是所有ELISPOT操作中唯一在“室溫”完成的操作步驟。但是，請注意生物學(xué)與化中的“室溫”是有嚴格所指的25°C±5°C，而不是籠而統之的所謂“室內溫度”。進(jìn)入秋冬季以來(lái)，我們接到大量客戶(hù)電話(huà)，說(shuō)ELISPOT斑點(diǎn)顏色淺，懷疑是不是抗體失活。有意思的是，這些客戶(hù)多數集中在長(cháng)江流域。經(jīng)過(guò)仔細核實(shí)，他們的問(wèn)題幾乎都是由于冬季室內沒(méi)有暖氣，室溫過(guò)低導致的顯色不足。特別注意：一旦顯色進(jìn)行了10分鐘以上，再提高溫度就沒(méi)什么意義了，因為酶已經(jīng)大部分失活。

為了實(shí)現ELISPOT的標準化，顯色最好在恒溫箱內進(jìn)行，溫度控制在25°C±5°C，顯色25分鐘為宜。另外，在37°C顯色也是不錯的一個(gè)方法，但要注意相應的縮短顯色時(shí)間到12-18分鐘，并且顯色中勤檢查。

斑點(diǎn)計數與數據處理
什么樣的點(diǎn)判定為ELISPOT有效斑點(diǎn)，什么樣的點(diǎn)不判定或者盤(pán)點(diǎn)為無(wú)效點(diǎn)，這就是斑點(diǎn)計數的“尺度”。為了實(shí)現標準化，必須統一“尺度”，不能搞“雙重標準”。統一尺度的前提是采用機器自動(dòng)計數。例如在BioReader4000上，我們一共有十多項獨立的參數，用來(lái)描述和判定斑點(diǎn)。這些參數可以單獨保存為“方法文件”。只要“方法文件”中的參數相同，斑點(diǎn)計數的“尺度”也就相同，標準化的斑點(diǎn)計數就有保障。

數據處理，包括數據綜合，陰陽(yáng)性判斷，數理統計等等。不論怎么處理，應該采取相同的處理方法，這沒(méi)有疑問(wèn)。

綜上所述，ELISPOT標準化的思想就是：在ELISPOT實(shí)驗的每一個(gè)環(huán)節都采用切實(shí)有效的步驟和方法，并且固定下來(lái)，從而最終保證實(shí)驗結果的重復性與可信度。