ELISPOT標準操作程序

第一天：ELISPOT包被程序，提供兩種方案供選擇（嚴格注意無(wú)菌操作）

方案A: 傳統酒精預濕包被程序
該方案中，需經(jīng)過(guò)：70％乙醇預濕PVDF膜、無(wú)菌去離子水洗滌去除乙醇、拍干，最后，加入已稀釋好的包被抗體到各實(shí)驗孔完成包被操作。
具體操作如下：
1. 實(shí)驗卡片填寫(xiě)：設計好試驗，把每個(gè)孔要加入的內容做成卡片，到時(shí)候就會(huì )從容很多。
2. 每孔加入15μL 70%的乙醇預濕。

注意：
未潤濕PVDF膜是潔白、不透明的；經(jīng)乙醇潤濕后，顏色變暗，呈半透明狀，很容易觀(guān)察二者的區別。
加乙醇時(shí)，槍頭應該靠在孔壁接近孔底的地方，注意槍頭不要刺到PVDF膜。
若加入的乙醇掛在孔壁上，蓋上板蓋，輕輕叩擊，讓乙醇順勢滑落。乙醇一旦接觸到PVDF膜，就會(huì )在表面張力和毛細作用之下迅速浸潤整塊膜，使得膜的顏色和透明度發(fā)生變化。
15μL是經(jīng)過(guò)優(yōu)化的體積，能保證剛好完全浸潤整塊膜，而不會(huì )有剩余。請勿隨意加大用量！
膜在潤濕后如果不做處理，大約10min后由于乙醇的揮發(fā)會(huì )重新變干。所以應該在膜變干之前加入去離子水，兩步的時(shí)間間隔不要超過(guò)5min。否則，膜需要重新潤濕。
3. 洗滌：100μL/孔加入去離子水，洗滌2次。
本次洗滌目的在于：除去預濕用的乙醇。因此應該盡量洗滌干凈，減少殘留。
4. 包被：按說(shuō)明書(shū)操作。50μL/孔加入用1×PBS稀釋好的包被抗體，4°C包被過(guò)夜。
5. 封閉：（次日）傾倒包被液，用無(wú)菌1×PBS洗滌3次。最后一次，在滅菌的吸水紙上扣干。200μL/孔加入稀釋好的封閉液，37°C封閉1h。
6. 傾倒封閉液，無(wú)須洗滌，直接加入檢測細胞進(jìn)行ELISPOT檢測。

方案B: Magi? Coating Buffer潤濕包被程序
該方案中，用Magi? Coating Buffer潤濕PVDF孔后，直接加入用1×PBS稀釋的包被抗體，即可完成抗體的包被。
1. 實(shí)驗卡片填寫(xiě)：設計好試驗，把每個(gè)孔要加入的內容做成卡片，到時(shí)候就會(huì )從容很多。
2. 每孔加入15μLMagi? Coating Buffer預濕。

注意：
未潤濕PVDF膜是潔白、不透明的，經(jīng)Magi? Coating Buffer潤濕后，顏色變亮，呈半透明狀，很容易觀(guān)察二者的區別。
加Magi? Coating Buffer時(shí)，槍頭應該靠在孔壁接近孔底的地方，注意槍頭不要刺到PVDF膜。
若加入的Magi? Coating Buffer掛在孔壁上，蓋上板蓋，輕輕叩擊，讓Magi? Coating Buffer順勢滑落。Magi? Coating Buffer一旦接觸到PVDF膜，就會(huì )在表面張力和毛細作用之下迅速浸潤整塊膜，使得膜的顏色和透明度發(fā)生變化。
3. 包被：潤濕之后，無(wú)須洗滌。每孔加入50μL PBS稀釋好的包被抗體，4°C包被過(guò)夜。
4. 封閉：（次日）傾倒包被液，用PBS洗滌3次。最后一次，在滅菌的吸水紙上扣干。200μL/孔加入用1×PBS稀釋好的封閉液，37°C封閉1h。
5. 傾倒封閉液，無(wú)須洗滌，直接加入檢測細胞進(jìn)行ELISPOT檢測。

第二天：接種細胞,加入刺激物，培養（嚴格注意無(wú)菌操作）
整個(gè)實(shí)驗設置1組正對照（PHA刺激），每一個(gè)細胞樣品（同一個(gè)捐獻者或實(shí)驗動(dòng)物）要設1組負對照（不加刺激物），整塊板還要加1組背景負對照（不含細胞，只加培養基和所有檢測試劑）。
1. 填好實(shí)驗卡片，用以指導實(shí)驗安排及細胞和試劑的添加。每一個(gè)細胞/刺激物的組合設復孔（建議2-4孔，客戶(hù)可根據實(shí)驗要求自行調整復孔數目）。
2. 取出封閉好的板，準備加入細胞。如果是以前做的封閉，先加入200μL的Lympho-Spot?無(wú)血清培養基室溫靜置10min，然后傾倒。
3. 細胞上板：按照實(shí)驗卡片的安排，接種不同濃度的細胞，100μL/well，細胞在孔中的分布要盡量均勻（要訣是加入細胞之后，不要再震動(dòng)或者拍擊ELISPOT板。有人認為拍擊板子會(huì )讓細胞更分散，實(shí)際情況剛好相反）。
（1）正對照：細胞濃度為1×104 cells/well。
（2）細胞樣品：樣品細胞濃度請實(shí)驗者自行摸索調整，通常為1～5×105cells/well。
（3）背景負對照：加入100μL的Lympho-Spot?無(wú)血清培養基，該孔即為背景負對照孔。
4. 刺激物：特異性刺激物和非特異性刺激物之分。
5. 正對照孔加入10μL PHA，終濃度1-4ug/mL，該濃度能有效刺激IFN-γ的分泌。
6. 加入實(shí)驗者自己的刺激物（用Lympho-Spot?無(wú)血清培養基配制成10×終濃度，10μL/well）到實(shí)驗孔。加完刺激物后不要再拍擊ELISPOT板。有人認為拍擊板子會(huì )讓刺激物在孔中混合均勻。實(shí)際上，通過(guò)擴散，刺激物會(huì )很快混合均勻。拍擊板子會(huì )讓細胞聚集分布在孔的外周。
7. 加完所有的樣品之后，蓋上板蓋，放入二氧化碳培養箱，37°C培養18-24h。

注意：
碰撞會(huì )引起細胞移位，造成斑點(diǎn)模糊、拖尾。在整個(gè)培養過(guò)程中應避免移動(dòng)、碰撞培養板，并盡量減少開(kāi)關(guān)培養箱的次數。

第三天：培養后操作（不再需要無(wú)菌操作）
1. 裂解細胞：傾倒孔內的細胞及培養基，200μL/孔加入冰冷的去離子水，4°C冰浴10min（低滲法裂解細胞）。
2. 洗滌：每孔加入200μLPBST，浸泡3-5mins后扣出洗滌液，重復5次。最后一次，在吸水紙上扣干。
3. 加入檢測抗體：每孔加入100μL稀釋好的生物素標記檢測抗體，37°C孵育1h。
4. 洗滌：每孔加入200μLPBST，浸泡3-5mins后扣出洗滌液，重復5次。最后一次，在吸水紙上扣干。

注意：
有實(shí)驗者認為，洗滌檢測抗體和酶標親和素時(shí)，膜的背面也需要清洗。經(jīng)我們驗證，不清洗膜的背面也完全可以得到滿(mǎn)意的結果，但是如果清洗，背景會(huì )更干凈一些。所以，清洗膜的背面為實(shí)驗的優(yōu)化步驟，是否略過(guò)，由實(shí)驗者自行決定。
洗滌膜的背面，我們的方法是：在洗滌最后一次時(shí)，將去除塑料保護層的PVDF膜板底面浸入盛有干凈PBST的淺托盤(pán)中，輕輕漂洗幾次即可。
一定要將膜背面和塑料保護層上的液體甩干后，再合攏，蓋上，不要劃傷到膜。
5. 加入酶標親和素：每孔加入100μL稀釋好的酶標親和素，37°C 1小時(shí)。
6. 洗滌：每孔加入200μLPBST，浸泡3-5mins后扣出洗滌液，重復5次。最后一次，在吸水紙上扣干。
7. 顯色：解凍已配好的AEC顯色液。每孔加入100μL的顯色液，室溫靜置15-45min（在20 -25°C，顯色25min較合適），注意避光。
8. 待斑點(diǎn)生長(cháng)到適合的大小之后，以去離子水洗滌2遍，終止顯色過(guò)程。將板倒扣在吸水紙上，拍干細小的水珠，之后取下保護層，放在通風(fēng)的地方，室溫靜置10-30min，讓膜自然晾干。注意不要將板放到烤箱內，防止膜發(fā)脆、破裂。
9. 將ELISPOT板置于Biosys Bioreader自動(dòng)讀板儀內，調節好合適的參數，斑點(diǎn)計數，并記錄斑點(diǎn)的各種參數，做統計分析。