為什么需要自動(dòng)化的ELISPOT圖像分析儀？

l 傳統手工計數方法

ELISPOT檢測的最終數據是細胞頻率（即在細胞群體中，受某種特異性抗原刺激而分泌某種細胞因子的陽(yáng)性細胞占細胞總數的比例）。細胞總數在試驗開(kāi)始已經(jīng)計數。需要統計的是陽(yáng)性細胞（也稱(chēng)斑點(diǎn)形成細胞（spot forming cells，SFC）數目。根據以前的技術(shù)研究，科學(xué)界已形成共識，每一個(gè)ELISPOT斑點(diǎn)對應唯一一個(gè)陽(yáng)性細胞。所以ELSPOT數據處理重要的工作就是進(jìn)行斑點(diǎn)計數。

手工計數一般是使用雙筒解剖鏡，在放大25倍的解剖鏡下，一個(gè)孔的底板剛好覆蓋一個(gè)完整的視野。實(shí)驗操作人員手持按壓式的計數器，對孔內的斑點(diǎn)逐一計數。手工計數很大的優(yōu)點(diǎn)就是可以利用人腦的智慧與經(jīng)驗：比如可以適應各種大小的斑點(diǎn)，排除各種假陽(yáng)性的斑點(diǎn)，能辨認復雜背景下的模糊斑點(diǎn)，等等。如果實(shí)驗者只是偶爾小規模的做一做ELISPOT，手工計數仍然是首選。但是手工計數也有致命的弱點(diǎn)。

l 手工計數效率低下、工作乏味，不能適應高通量篩選

假設一個(gè)ELISPOT孔有200個(gè)斑點(diǎn)（這不能算多，一個(gè)孔可以容納上千個(gè)斑點(diǎn)），計數前先要定位，接著(zhù)要對焦，對焦完成之后要計數至少兩遍（以保證數據的可靠性）。保守估計，這樣一個(gè)孔的計數與處理工作需要10分鐘。那么整塊板96個(gè)孔完成數據處理需要960分鐘，也就是大約兩個(gè)工作日。如果同時(shí)做5塊板的檢測，那么光是最后的數據處理就需要十個(gè)工作日，也就是兩周時(shí)間！此外，手工計數工作本身的單調、機械和重復，也是常人無(wú)法長(cháng)時(shí)間忍受的。

作為對比，BioReader 4000完成一個(gè)孔只需要6-7秒鐘，完成一塊板需要10分鐘，完成五塊板的數據分析并且打印出詳細的結果報告也僅僅需要1小時(shí)。

l 手工計數很難保證統一的標準

我們知道，在斑點(diǎn)計數之前先要設定一系列的判定標準。比如斑點(diǎn)的形狀，圓形度，邊緣至中心的漸變梯度，半點(diǎn)的直徑，斑點(diǎn)與背景對比度，等等。然后再應用相同的標準對所有的孔，包括實(shí)驗孔與正負對照孔進(jìn)行計數。這樣才能給出公正客觀(guān)的結果，避免出現事實(shí)上的“雙重標準”。但是我們知道，人的主觀(guān)性隨意性很強。即使并非出于故意，在執行標準的時(shí)候，也難保自始至終能夠執行統一標準而不走樣。

作為對比，BioReader 4000可以設定各種參數與判定標準，這些參數與標準可以保存成單一的“方法文件”保存或者通過(guò)E-mail傳遞，任何時(shí)候、任何地點(diǎn)都能保證相同的讀板標準。

l 機器計數可以獲得斑點(diǎn)大小分布信息，手工計數做不到

從前面的1.2節我們知道，同種細胞受同種刺激物刺激，斑點(diǎn)大小服從正態(tài)分布。但是細胞或者刺激物任何一種改變都會(huì )導致不同種類(lèi)的斑點(diǎn)產(chǎn)生，這就有可能在同一孔內出現兩種或者兩種以上的斑點(diǎn)。

為了便于說(shuō)明問(wèn)題，我們來(lái)看一個(gè)實(shí)際例子。如圖8.1所示，這是某位乙肝病人用HBcAg刺激的ELISPOT結果。A是負對照，不加HBcAg刺激也出現了較多斑點(diǎn)。B是用HBcAg刺激的結果，斑點(diǎn)數目是增加了，但是差別不顯著(zhù)。如果僅僅只是斑點(diǎn)計數的話(huà)，如圖D表格的倒數第二行所示，負對照比實(shí)驗孔，斑點(diǎn)總數為189：380，相差只有一倍。

但是仔細對比圖A、圖B，我們發(fā)現，圖B中似乎有兩種斑點(diǎn)，一種是和圖A相同小斑點(diǎn)，此外還有一些大的斑點(diǎn)。借助于機器，我們可以輕松獲得A、B孔中的斑點(diǎn)直徑分布圖，圖C。從圖C我們可以知道，原來(lái)實(shí)驗孔中真的有兩種斑點(diǎn)，分別對應正態(tài)分布圖中的兩個(gè)峰。兩個(gè)峰的分界點(diǎn)在100μm處。小于100μm的斑點(diǎn)與負對照孔相同，是非特異性斑點(diǎn)，屬于細胞自發(fā)產(chǎn)生；大于100μm的斑點(diǎn)是特異性斑點(diǎn)，由HBcAg刺激產(chǎn)生。

由于有了充足的信息與理由，我們可以在最后斑點(diǎn)計數的時(shí)候，把斑點(diǎn)直徑的閾值設定為100μm：我們只計數大于100μm的斑點(diǎn)，小于100μm的斑點(diǎn)不予計數。這樣負對照孔與實(shí)驗孔的最終結果為3：50，相差有17倍！這比最初相差一倍的結果顯著(zhù)得多。

以上的例子說(shuō)明，某些場(chǎng)合ELISPOT圖像分析儀可以提供額外的重要信息，這是手工計數完全無(wú)法做到的。 

l 機器計數可以獲得細胞因子相對定量信息，手工計數做不到

我們知道，通過(guò)ELISPOT斑點(diǎn)計數可以提供陽(yáng)性細胞頻率的數據。也就是說(shuō)，在給定細胞群體當中，我們可以知道有多少細胞在分泌細胞因子。但是另一方面，我們也希望知道這些細胞分泌細胞因子的相對數量。尤其是在經(jīng)過(guò)某些處理的情況下，陽(yáng)性細胞的頻率沒(méi)有變化，但是細胞的平均分泌量增加了。我們也希望ELISPOT檢測能夠提供這方面的數據。這種數據的獲得就依賴(lài)于ELISPOT 圖像分析儀的斑點(diǎn)光密度分析功能。手工計數是無(wú)法獲得的。

那么，如何來(lái)確定每個(gè)斑點(diǎn)代表的細胞因子數量呢？顯然斑點(diǎn)的面積可以作為一個(gè)度量，細胞因子分泌越多，斑點(diǎn)就越大。反之亦然。另外，斑點(diǎn)顏色深淺（也稱(chēng)為：光密度）也可以作為一個(gè)度量，細胞因子分泌越多，斑點(diǎn)顏色就越深，反之亦然。打一個(gè)簡(jiǎn)單的比方，把一個(gè)斑點(diǎn)比作一座山峰，斑點(diǎn)的面積就是山峰的占地面積，斑點(diǎn)的深淺就是山峰的高度，細胞因子的總量就是山峰的體積。那么經(jīng)過(guò)一個(gè)簡(jiǎn)單的數學(xué)微積分處理，就可以根據每個(gè)面積單元的高度而把山峰的重體積積分出來(lái)。ELISPOT斑點(diǎn)光密度定量就使用的這個(gè)原理。

如圖8.2所示，這是BioReader 4000光密度分析報告。它可以提供的信息有：孔的位置、每孔的斑點(diǎn)數目、該孔斑點(diǎn)的平均光密度（Average Opt. Density）、該孔斑點(diǎn)的總面積（Cumulated values area）、該孔相對細胞因子分泌總量（TOD，即光密度總值）。

需要指出的是，光密度分析只能提供細胞因子分泌量的相對值，而不能提供細胞因子的絕對分泌量。原因是很顯然的，諸多因素都對斑點(diǎn)的大小和顏色的深淺有影響。所以我們只能通過(guò)同一次實(shí)驗，在實(shí)驗條件完全相同的情況下，比較不同細胞、不同刺激物或者不同處理帶來(lái)的細胞因子分泌量的相對變化。