ELISPOT結果分析之——細胞數與斑點(diǎn)頻率

ELISPOT檢測的是陽(yáng)性細胞的頻率，也就是出斑點(diǎn)的細胞占整個(gè)加入細胞的比例。不僅要計數斑點(diǎn)，也要計數孔中加入的細胞。每孔加入的細胞有一個(gè)上限，大約是60萬(wàn)，這是96孔板每個(gè)孔能容納的細胞極限，超過(guò)這個(gè)極限，細胞就不再單層平鋪在孔底了。而ELISPOT檢測的前提條件是細胞單層平鋪在孔底。

理論上說(shuō)，同一次實(shí)驗，孔內的斑點(diǎn)數量應該和加入孔中的細胞數量成正比，不論加入細胞多少，陽(yáng)性細胞的頻率是恒定的。正是基于這一前提，ELISPOT檢測的單位被定義為，每百萬(wàn)細胞中陽(yáng)性細胞的數目，英文SFC/Million (Spots Forming Cells per Million cells)。

但是實(shí)際情況究竟怎樣呢，斑點(diǎn)數量真的和細胞數量成正比嗎？

經(jīng)過(guò)反復的實(shí)踐，我們發(fā)現這條規律只有在特定的前提下才成立。這個(gè)前提就是有足夠的抗原呈遞細胞（APC）密度，以滿(mǎn)足細胞間的相互作用。由于特異性的ELISPOT反應都需要APC把抗原呈遞給T細胞，所以只有APC充足的時(shí)候，斑點(diǎn)數目才和細胞數目成正比。

通常的ELISPOT檢測是不單獨制備APC的，而是依靠混合在淋巴細胞中的APC擔負抗原呈遞的作用。好在PBMC和小鼠脾臟淋巴細胞都含有足夠的APC，在特定的細胞濃度下都會(huì )發(fā)揮正常的抗原呈遞功能。另外，不同的刺激物類(lèi)型對APC的要求也不一樣，需要具體情況具體分析。

l 非特異性刺激物

非特異性的刺激物可以直接刺激淋巴細胞，這種刺激不依賴(lài)于A(yíng)PC或者其它輔助細胞，是單細胞反應行為。所以它對細胞密度沒(méi)有要求，在極寬的細胞濃度范圍之內——多至40萬(wàn)/孔，低至5千/孔——斑點(diǎn)數量和細胞數量都有簡(jiǎn)單的正比例關(guān)系，參見(jiàn)圖4.2。但是考慮到，只有恰當的斑點(diǎn)數目才便于數據統計，所以推薦細胞密度為10萬(wàn)/孔。如果細胞數目過(guò)多，滿(mǎn)孔都會(huì )被斑點(diǎn)覆蓋，并且相互重疊。

l T細胞表為肽/CEF/ICE

T細胞表位肽比較特殊。一方面，它需要APC的呈遞，是雙細胞反應行為；另一方面它不需要APC的加工，對于A(yíng)PC的依賴(lài)相對較低。以使用ICE多肽庫為例，實(shí)踐中我們發(fā)現在5萬(wàn)/孔—60萬(wàn)/孔的細胞濃度范圍內，都可以獲得很好的斑點(diǎn)數與細胞數的線(xiàn)性關(guān)系（參見(jiàn)圖4.2）。通常我們推薦20萬(wàn)/孔的細胞密度。如果在這樣的細胞密度下，斑點(diǎn)過(guò)多或者過(guò)少，可以根據實(shí)際情況，在線(xiàn)性范圍許可的限度內減少或者增加每孔種植的細胞密度。

l 普通多肽/蛋白/組織提取物

不論是普通多肽（比如重疊多肽庫）還是蛋白質(zhì)或者蛋白類(lèi)的組織提取物，這些刺激物都需要APC的攝取、內化、加工、呈遞，之后T細胞才能被刺激。所以，使用這些刺激物的時(shí)候，一定要保證足夠的細胞密度。根據我們的經(jīng)驗，細胞密度要至少達到20萬(wàn)-30萬(wàn)每孔。多肽推薦的細胞密度為30萬(wàn)/孔，蛋白推薦的細胞密度為40萬(wàn)/孔。也可以根據實(shí)際情況，在線(xiàn)性范圍內調整，參見(jiàn)表4.1與圖4.2。