ELISPOT檢測的質(zhì)量控制

      那么如何能控制ELISPOT檢測的質(zhì)量呢？如果有一種細胞和一種刺激物，并且ELISPOT斑點(diǎn)頻率是已知的話(huà)，那么就有了一個(gè)ELISPOT的標準系統。每次其它樣品檢測時(shí)，只要帶上這個(gè)系統，實(shí)驗者就可以用標準系統來(lái)質(zhì)控待測樣品的ELISPOT檢測。這也是所有其它檢測質(zhì)控的基本原理。

      現在的關(guān)鍵是找到這樣一種細胞和一種刺激物，每次都能做出完全相同的ELISPOT結果。

二、標準細胞必須采用凍存細胞庫

     首要問(wèn)題是細胞。我們知道，細胞是有生命的，不像無(wú)生命的物質(zhì)那樣容易保存。那么能不能采用新鮮細胞呢，比如每次都從同一個(gè)志愿者身上采集？不能。因為志愿者的健康狀態(tài)和免疫狀態(tài)都是動(dòng)態(tài)的，雖說(shuō)采自同一個(gè)人，但是細胞免疫水平可能會(huì )有變化，ELISPOT結果無(wú)法完全重復。那么能不能采集細胞之后長(cháng)期飼養呢？不能。且不說(shuō)長(cháng)期培養成本高且周期長(cháng)，細胞本身的免疫水平和克隆數目都會(huì )隨著(zhù)培養和傳代而發(fā)生變化。

      能滿(mǎn)足ELISPOT檢測長(cháng)期不變化的只能是凍存細胞庫。一次采集大量細胞凍存在-197°C的液氮環(huán)境中，細胞的斑點(diǎn)頻率可以在數年之內恒定不變。PBMC分離和凍存復蘇的方法參見(jiàn)本網(wǎng)站內容。

三、標準刺激物選用CEF或者ICE

     那么，刺激物選擇什么呢？非特異性的刺激物很便宜，但是不能用于質(zhì)控。三個(gè)原因阻礙了這一點(diǎn)。

    其一、非特異性的刺激物刺激效果不穩定。如圖9.2所示，非特異性的刺激物（有絲分裂原Mitogen）的刺激曲線(xiàn)幾乎沒(méi)有平坦的部分。也就是說(shuō)，刺激物的濃度有細微變化，馬上就會(huì )體現在刺激斑點(diǎn)數目的變化上了，這樣實(shí)驗結果很難完全重現。相反，抗原的刺激曲線(xiàn)非常平坦，只要達到有效刺激濃度，斑點(diǎn)頻率就不再變化。

     其二，非特異性刺激物的刺激原理與特異性的刺激物刺激原理不同。一般來(lái)說(shuō)，質(zhì)控系統和被質(zhì)控的體系之間越相近越好：經(jīng)過(guò)相同的處理，接受相同的影響因素，發(fā)生相同的物理、化學(xué)、生物過(guò)程。但是非特異性刺激物刺激是單細胞過(guò)程，與抗原經(jīng)APC呈遞而刺激T細胞是完全不同的過(guò)程。所以用非特異性刺激反應質(zhì)控與特異性刺激反應質(zhì)控，從原理上也說(shuō)不同。

     其三，非特異性刺激物多數是蛋白質(zhì)，比如PHA與ConA，效價(jià)不穩定，容易失活，不易保存。相對而言，作為抗原的蛋白和多肽，免疫原性和刺激效果要穩定得多。

      綜上所述，在質(zhì)控系統中，標準刺激物宜選用抗原?？乖?，以T細胞表位肽組成簡(jiǎn)單，機理清楚，結果穩定，所以是首選。再則考慮到標準刺激物對健康人的T細胞也應該能刺激作用，所以國際上選定三種常見(jiàn)病毒CMV、EBV、Flu Viurs，把它們的32條T細胞表位肽集中起來(lái)，作為ELISPOT標準樣性刺激物CEF。另有簡(jiǎn)化版的23條肽肽庫ICE（貨號CT370），更加實(shí)用。 

 四、實(shí)驗室內部質(zhì)控與實(shí)驗室之間的質(zhì)控以及國家質(zhì)控體系

      以上介紹了ELISPOT質(zhì)控系統的原理與組成?，F在來(lái)介紹一下質(zhì)控系統的應用范圍。根據質(zhì)控系統的應用范圍，可以分為以下三個(gè)層次。

     基本的層次是實(shí)驗室內部質(zhì)控系統。比如一個(gè)實(shí)驗室有好幾組實(shí)驗人員，會(huì )在很長(cháng)的時(shí)間內（一年或數年）做高質(zhì)量的ELISPOT檢測。這就需要用到實(shí)驗室內部的質(zhì)控系統。因為實(shí)驗室內部的條件相對穩定，管理相對統一，實(shí)驗室內部質(zhì)控系統的技術(shù)目前已經(jīng)非常成熟。達科為公司有整套建立實(shí)驗室內部ELISPOT質(zhì)控系統的方案，已經(jīng)幫國內數家實(shí)驗室建立了這一系統。實(shí)踐也證明了該系統有效可行，指控效果非常明顯。

     第二個(gè)層次是實(shí)驗室之間的質(zhì)控系統。當今的科研有合縱連橫的趨勢，一些重大的科研項目或者疫苗的臨床評估往往是跨實(shí)驗室、跨地域甚至跨國家的聯(lián)合項目。為了使這些分布在不同地區不同時(shí)間的ELISPOT檢測有相同的標準和可信度，必須采用實(shí)驗室之間的質(zhì)控系統。就我們達科為公司與國內十余家實(shí)驗室聯(lián)合作的評估而言，實(shí)驗室之間的質(zhì)控存在唯一的一個(gè)非技術(shù)障礙，那就是凍存質(zhì)控細胞的運輸問(wèn)題。

     凍存細胞更好能通過(guò)液氮運輸，如果采用小型背負式液氮罐，實(shí)驗者可以在同一城市的不同實(shí)驗室之間運輸凍存細胞，但是對于跨城市或者跨國家的長(cháng)途運輸就不太可能了。液氮罐上飛機或者火車(chē)都是非法的。如果采用干冰運輸，凍存細胞的狀態(tài)和存活率就會(huì )打折扣。我們的研究表明，經(jīng)過(guò)干冰運輸的細胞，存活率只有80%左右。并且干冰運輸的可靠性也不能完全得到保證，一旦干冰耗盡或者細胞未完全被干冰包裹，細胞的存活率就會(huì )直線(xiàn)下降，甚至完全死亡。

     第三個(gè)層次是國家質(zhì)控系統。任何成熟的檢測技術(shù)都會(huì )有相應過(guò)國家標準和質(zhì)控系統。但是由于ELISPOT技術(shù)還在發(fā)展中，目前世界上還沒(méi)有任何一個(gè)國家建立了ELISPOT技術(shù)的國家標準和質(zhì)控系統。美國是該項工作開(kāi)展得比較早的國家，目前仍然在不同實(shí)驗室之間作驗證工作，研究建立質(zhì)控系統的可行性。

    如表9.1所示，這是我們一次實(shí)驗的結果?？梢钥吹?，前三個(gè)實(shí)驗室的結果重復性很好，但是第四個(gè)實(shí)驗室的結果明顯偏小。