關(guān)于細胞凍存復蘇的理論知識

可能很多讀者對細胞的凍存復蘇的實(shí)驗操作與步驟心存疑慮，在這里給大家介紹一些關(guān)于細胞凍存復蘇方面的理論知識。

基本概念：存活率與恢復率

細胞凍存復蘇的質(zhì)量可以通過(guò)存活率（viability）來(lái)衡量。即在細胞復蘇、洗滌后，用臺盼藍進(jìn)行細胞計數。存活率 = 活細胞數 / 細胞總數×100%。經(jīng)臺盼藍染色，活細胞呈無(wú)色，晶瑩透亮；死細胞呈藍色，暗淡無(wú)光，直徑比活細胞大1-2倍。

一般來(lái)說(shuō)，如果細胞的存活率低于70%，ELISPOT檢測結果會(huì )很糟糕。補救辦法是讓細胞休息過(guò)夜，或者采用預孵育ELISPOT方法（見(jiàn)4.6節），檢測結果會(huì )有改善。如果細胞存活率高于80%會(huì )獲得較滿(mǎn)意的ELISPOT結果。如果嚴格按本實(shí)驗規范，可以保證存活率達90%。在此存活率下，復蘇細胞可以直接做ELISPOT檢測，不需休息過(guò)夜。

與存活率相關(guān)聯(lián)但又有顯著(zhù)區別的另一個(gè)概念是恢復率（recovery）?；謴吐适侵竷龃?、復蘇之后回收到的活細胞和凍存前活細胞的比例?；謴吐实母叩腿Q于兩個(gè)影響因素，即存活率和洗滌丟失比例。使用本試劑盒，細胞的存活率很高，它對恢復率的影響可以忽略。所以對恢復率的主要影響因素是洗滌過(guò)程中細胞的丟失。本操作手冊中有兩步洗滌，推薦的離心條件是400g離心10min，按照這種操作，細胞的丟失應該在可接受的范圍之內。同時(shí)我們推薦較高的細胞凍存濃度，即1x107cells/ml，甚至可以更高。如果細胞達不到這種濃度，也至少應該達到5×106cells/ml。

細胞為什么會(huì )被凍死？

使細胞死亡的原因并不是低溫，相反，低溫可以減緩甚至暫停細胞生命運動(dòng)，使其長(cháng)期保存。讓細胞死亡的真正原因是水。不錯，正是水分。水分在冷凍的過(guò)程中會(huì )結冰，從而給細胞帶來(lái)雙重傷害。

第一重傷害在于水結冰的過(guò)程。我們知道，冰是一種晶體。結冰的過(guò)程，就是水分子不斷的填充到冰晶的陣列當中，使冰晶體不斷長(cháng)大的過(guò)程?？催^(guò)水晶的人對晶體都會(huì )有一種直觀(guān)認識，那就是晶體有非常分明的棱角，冰晶也是這樣。不論是細胞內、還是細胞外的冰晶，在生長(cháng)過(guò)程中能夠不斷的外延，很容易就會(huì )刺破細胞的各種生物膜，尤其是質(zhì)膜，從而導致細胞死亡。這是細胞被凍死的首要原因。

第二重傷害機制很好理解，那就是水在結冰的過(guò)程中，體積會(huì )增加1/10。體積膨脹伴隨的微觀(guān)運動(dòng)會(huì )使各種水合蛋白原子之間發(fā)生位移，化學(xué)鍵被扭曲，導致蛋白變性失活。各種蛋白制劑要避免反復凍融就是這個(gè)道理。體積膨脹伴隨的宏觀(guān)運動(dòng)會(huì )使各種封閉的細胞器、細胞核乃至整個(gè)細胞也跟著(zhù)膨脹，有可能在膨脹過(guò)程中發(fā)生生物膜破裂事件。由水的體積膨脹導致的傷害相對來(lái)說(shuō)居于次要地位。

這兩重傷害是如此的嚴重，以致于脆弱的哺乳動(dòng)物細胞如果不添加保護劑，幾乎都會(huì )在凍融的過(guò)程中死亡。那么，凍存保護劑又是什么東西呢？

凍存保護劑的原理是什么？

凍存保護劑分兩類(lèi)，保護原理各不相同。第一類(lèi)稱(chēng)為細胞外保護劑，多是高分子物質(zhì)，比如甲基纖維素，聚乙二醇（PEG），血清白蛋白等等；第二類(lèi)稱(chēng)為細胞內保護劑，比如甘油、二甲基亞砜（DMSO）等等。

第一類(lèi)保護劑的作用是分隔細胞外的溶液空間，阻止細胞外大冰晶的形成。因為細胞外保護劑都是高分子，一方面自身會(huì )結合大量自由的水分子，另一方面也會(huì )阻止未結合的自由水分子的運動(dòng)，形成一個(gè)個(gè)相對阻隔的小空間。冰晶的形成與生長(cháng)就被限定在這樣一個(gè)個(gè)相互阻隔的小空間內，不能形成大的冰晶。也就是說(shuō)，把原先少數大的冰晶分隔成了無(wú)數細微的小冰晶，極大地減少了對細胞膜的威脅。

第二類(lèi)保護劑能進(jìn)入細胞內，起到雙重保護效果。第一重保護效果是保護細胞蛋白質(zhì)，減輕凍融作用對蛋白質(zhì)的損傷。因為內保護劑都是親水的小分子，可以取代蛋白質(zhì)表面的水合層，減輕水凍結膨脹造成的原子位移與化學(xué)鍵破壞。第二重保護是破壞細胞內冰晶的晶格結構，防止形成大的冰晶刺破細胞器與質(zhì)膜。我們知道，晶體的生長(cháng)是組成晶格的原子分子有序點(diǎn)陣堆積的結果。但是進(jìn)入細胞內的這些親水小分子可以取代水分子而堆積到冰晶的晶格中，造成晶體的結構缺陷。缺陷嚴重到一定程度，晶體就不再增長(cháng)，對細胞結構的破壞也就降低了。另外還有證據表明，像DMSO可以起到水的結晶核作用，大量的結晶核相互競爭水分子，導致這些冰晶都長(cháng)不大。

U-Cytech Cryostar?凍存試劑是各種凍存保護劑的優(yōu)化與集大成者。重懸液中含有多種細胞外保護劑，2倍凍存液含同時(shí)含有細胞外凍存保護劑和細胞內凍存保護劑，可以保證凍存的合適效果。

為什么要慢凍快融？

除了凍存保護劑之外，冷凍和升溫的速度也直接影響細胞的存活率。做過(guò)細胞凍存復蘇的人都可能聽(tīng)說(shuō)過(guò)“慢凍快融”的原則。這條原則背后的科學(xué)道理是什么呢？

慢凍是為了減少細胞內的水分，從而降低水分結冰導致的傷害。為了說(shuō)清這個(gè)道理，需要一點(diǎn)點(diǎn)物理學(xué)知識。我們知道，水溶液結冰是一個(gè)溶質(zhì)溶劑相互作用的過(guò)程。溶液的濃度越高，開(kāi)始結冰的溫度（冰點(diǎn)）就越低。溶液結冰時(shí)，作為溶劑的水優(yōu)先結冰，同時(shí)把溶質(zhì)外排，這樣就導致溶質(zhì)的濃度越來(lái)越高。溶質(zhì)的濃度越高，則剩下的溶液要進(jìn)一步結冰，需要的溫度就更低，直到一個(gè)最終完全結冰的溫度（共熔點(diǎn)）。也就是說(shuō)，水溶液的結冰是一個(gè)溫度逐漸降低（從冰點(diǎn)最后降低到共熔點(diǎn)）、溶液濃度逐漸升高的過(guò)程。

但是這樣的結冰過(guò)程也是有條件的，那就是外界的溫度不能急劇降低，讓溶劑結冰的時(shí)候，有足夠的時(shí)間把溶質(zhì)排除到冰體之外。否則，溫度降低太快，溶質(zhì)就會(huì )被困在溶劑中間一同凝固，這在物理學(xué)上叫玻璃化凝固，而非真正的結冰。慢凍就是為了讓凍存液真正結冰，結冰的過(guò)程中，凍存液的濃度會(huì )逐漸提高，滲透壓也逐漸提高，細胞內的水分就會(huì )逐漸滲透到細胞外，從而減弱細胞內水分結冰導致的傷害。

理論和實(shí)踐表明，細胞冷凍的速度控制在每分鐘降低1°C效果好。Nalgene公司的程序降溫盒“Mr. Frosty”放置在-70℃冰箱內能夠提供接近于1℃/min的降溫速度。此外還有專(zhuān)門(mén)的程序降溫儀也能?chē)栏窨刂苾龃婕毎慕禍厮俾?。我們不推薦任何傳統辦法，傳統辦法的人為因素太大，效果不穩定。

那么快融又是什么道理呢？快融是為了防止融解過(guò)程中的局部區域發(fā)生反復凍融。

 DMSO的特殊性所帶來(lái)的特殊實(shí)驗操作

二甲基亞砜（DMSO）是一種有效的細胞內保護劑，Cryostar? 2×凍存液含有DMSO。DMSO具有脂溶性，細胞毒性，密度比水大。正是由于這些特殊性質(zhì)，所以在細胞凍存復蘇中會(huì )有一些相應的特殊操作。

先說(shuō)脂溶性。DMSO能自由穿越細胞的脂質(zhì)雙分子層。穿透的速度取決于細胞內外兩側的濃度差。如果穿透速度太快，膜結構與膜蛋白都會(huì )受到損傷。所以，要控制細胞內外的DMSO濃度差，不能變化太劇烈。一方面，滴加凍存液時(shí)，DMSO的濃度要緩慢增加；另一方面復蘇洗滌時(shí)，DMSO的濃度要緩慢下降。這就是在凍存和復蘇程序中多處出現“逐滴加入”“緩慢加入”的原因。

接著(zhù)說(shuō)毒性。沒(méi)錯，DMSO確實(shí)有細胞毒性！但是它在凍存中能有效保護細胞，所以?xún)龃嬉憾茧x不開(kāi)DMSO，我們要做的只能是減少DMSO對細胞的毒性。我們都知道，溫度越低，細胞的生命活動(dòng)越弱，對有毒物質(zhì)的耐受就越強。凡是涉及到DMSO的地方我們都會(huì )提到“冰上操作”，用低溫來(lái)減弱DMSO的毒性，這就是原因所在。

最后說(shuō)密度。DMSO的密度大于水。Cryostar? 2×凍存液含有DMSO，所以它的密度大于普通培養基和血清。為了獲得充分的混合效果，一方面，在凍存程序中，Cryostar? 2×凍存液要滴加到Cryostar?重懸液液面之上，這樣高密度的Cryostar? 2X凍存液就能靠重力的作用和下面低密度的Cryostar?重懸液有效混合；另一方面，在復蘇程序中，低密度的血清和RPMI-1640培養基要緩慢加入到高密度凍存液液體的下方，這樣低密度的液體靠浮力作用就能和上方的細胞凍存液有效混合。