ELISPOT技術(shù)的歷史與發(fā)展

        1. ELISPOT技術(shù)的創(chuàng )立

  l 先驅?zhuān)?/span>Don Mason

ELISPOT技術(shù)的原型起初可以追朔到1978年的牛津大學(xué)，工作于此的Don Mason教授在隨后的兩年研究期間，開(kāi)創(chuàng )了一種“膠片上的斑點(diǎn)技術(shù)”。

他的做法如下：首先在蓋玻片上包被抗原，然后把玻片放到細胞培養皿的皿底；接著(zhù)在培養皿內加入B細胞，有些B細胞已經(jīng)分化為漿細胞，能夠大量分泌特異性的抗體，分泌出來(lái)的抗體就會(huì )和蓋玻片上的抗原結合；大約3-5個(gè)小時(shí)之后，洗去玻片上的B細胞和各種雜質(zhì)，然后把玻片浸入被放射性碘同位素標記的二抗溶液中孵育一小時(shí)；洗滌之后，在玻片上覆蓋膠片放色自顯影，一個(gè)個(gè)斑點(diǎn)就在膠片上顯示出來(lái)了。每一個(gè)斑點(diǎn)就代表了一個(gè)分泌特異性抗體的漿細胞。

如果把ELISPOT技術(shù)的核心定義為：“將細胞的分泌行為通過(guò)斑點(diǎn)顯示出來(lái)”，那么Don Mason教授這種“膠片上的斑點(diǎn)”已經(jīng)具備了ELISPOT技術(shù)的基本特征，并且也滿(mǎn)足“一個(gè)陽(yáng)性細胞，對應一個(gè)ELISPOT斑點(diǎn)”這條原則。所以把英國牛津大學(xué)的Don Mason教授稱(chēng)為ELISPOT技術(shù)先驅絲毫不為過(guò)。

l 創(chuàng )立：Sedgwich與Czerkinsky

ELISPOT技術(shù)的真正創(chuàng )立要等到5年之后的1983年。這一年，在南北兩個(gè)半球地理位置相距遙遠的兩個(gè)研究小組幾乎同時(shí)、獨立地創(chuàng )立了這項技術(shù)。一個(gè)研究小組位于澳大利亞西部的柏斯Peth，牽頭人是當時(shí)正在當地Margaret女王醫院兒童醫學(xué)研究所攻讀博士學(xué)位的Jonathon D. Sedgwich （Sedgwick JD et. al., 1983）。另一個(gè)研究小組位于北歐瑞典城市哥德堡Gothenburg，帶頭人是哥德堡大學(xué)醫學(xué)微生物系的學(xué)者Cecil C. Czerkinsky（Czerkinsky CC et. al., 1983a）。

受當時(shí)新興技術(shù)ELISA的啟迪，Sedgwich與Czerkinsky都選取了塑料微孔板作為固相材料。這種塑料的微孔板既可以作為抗原包被的載體，也可以作為細胞孵育的場(chǎng)所。他們將抗原包被到微孔板的板底，然后加入B細胞孵育。在此過(guò)程中，一部分B細胞分泌的特異性的抗體與板底的抗原結合。在實(shí)驗初期，他們都選擇了酶標記的二抗，而非放射性同位素標記的二抗。推測也是受到了ELISA技術(shù)的啟迪。

但是問(wèn)題也隨酶標二抗而至，當時(shí)的顯色底物都是可溶的。這對于ELISA根本不是問(wèn)題，因為ELISA就是要檢測可溶底物的光密度。但如果ELISPOT顯色底物也可以溶解的話(huà)，那么產(chǎn)生的斑點(diǎn)將隨著(zhù)溶液微小的擾動(dòng)而消失。對此，他們不約而同地想到了把顯色底物做成瓊脂糖的凝膠，通過(guò)凝膠固定可溶的色素分子，從而產(chǎn)生斑點(diǎn)。

前者開(kāi)創(chuàng )ELISPOT方法是為了研究B淋巴細胞分泌IgM抗體的情況（Holt PG et. al., 1984；Sedgwick JD et. al., 1984）；而后者除了用于研究B淋巴細胞分泌抗體的情況（Czerkinsky CC et. al., 1983b; 1983c），還應用于大腸桿菌分泌腸毒素（Czerkinsky CC et.al., 1983a）和成纖維細胞分泌纖維連接蛋白（Czerkinsky CC et. al., 1984）的研究。雖然研究的對象不一樣，但該實(shí)驗技術(shù)所涉及的原理以及方法步驟和我們現在標準ELISPOT幾乎完全相同。

Sedgwick論文發(fā)表的時(shí)間略早一些，Czerkinsky則發(fā)明了“ELISPOT”這個(gè)名詞，由于他們的研究都是各自獨立開(kāi)展，所以被公認為ELISPOT技術(shù)的創(chuàng )立人。

這二十多年來(lái)，ELISPOT基本原理并沒(méi)有什么重大變化，但技術(shù)卻一直在進(jìn)步，諸如：檢測材料的改進(jìn)，實(shí)驗靈敏度與重復性的提高，實(shí)驗應用領(lǐng)域的拓寬等。

2. ELISPOT技術(shù)的發(fā)展

l 底板材質(zhì)的改進(jìn)

ELISPOT技術(shù)先驅者DonMason用的固體基質(zhì)是玻璃片，由于玻璃片使用不便等諸多因素的影響，致使該技術(shù)在當時(shí)并沒(méi)有得到很好的推廣。Sedgwich與Czerkinsky創(chuàng )立ELISPOT技術(shù)之后，檢測底板都是使用普通的塑料板，它的蛋白吸附能力差，因此實(shí)驗靈敏度有限。1985年，Moller SA和Borrebaeck CA 將膜板引入ELISPOT中（Moller SA et. al., 1985），檢測的也是分泌抗體的陽(yáng)性B細胞。他們引入的是硝酸纖維素膜（NC膜），獲得了遠優(yōu)于塑料板的結果。

不過(guò)硝酸纖維素（包括醋酸纖維素）也有自身的不足。由于它是天然纖維素經(jīng)過(guò)人工酯化后獲得的，纖維排列不規則，膜表面的平整度差，導致表面形成的斑點(diǎn)外形破碎，高低錯落，并且邊緣彌散。這就好比在粗糙的麻布上寫(xiě)小字，字跡就會(huì )模糊不清。另外纖維素還存在機械承受力差，化學(xué)穩定性差，不利于長(cháng)時(shí)間保存等缺點(diǎn)。但有一點(diǎn)，硝酸纖維素膜不需預先用酒精潤濕，所以現在BD公司還在沿用維素膜板。

1995年，荷蘭Utrecht大學(xué)免疫研究所的Schielen P團隊 把一種更優(yōu)于硝酸纖維素膜的PVDF膜也引入了ELISPOT檢測中（Schielen P et. al., 1995）。PVDF（聚偏二氟乙烯）是完全人工合成的，可以控制其纖維的長(cháng)度與排列方式，從而獲得幾乎完美的膜結構。做過(guò)Westernblot的人都知道，PVDF膜比硝酸纖維素膜有更優(yōu)異的蛋白吸附性質(zhì)，更加均勻的膜結構，更加精細的顯色條帶分辨率，更強的機械承受力與耐化學(xué)腐蝕性能。PVDF膜上的斑點(diǎn)質(zhì)量是纖維素膜上的斑點(diǎn)所無(wú)法相比的。本手冊中所有的紅色斑點(diǎn)都是使用Millipore公司PVDF板做出來(lái)的。有一點(diǎn)要提醒，PVDF膜本身是疏水的，需要預先用乙醇潤濕。PVDF膜的引入是繼硝酸纖維素膜之后，ELISPOT底板材料的又一次重大突破（McCutcheon M et. al., 1997）。至今，除了BD公司還在堅持使用纖維素膜板之外，其余所有的ELISPOT試劑公司都用PVDF膜取代了纖維素膜（Weiss AJ 2005）。

塑料板被膜板取代之后，沉寂了許多年。近幾年又開(kāi)始興旺起來(lái)（Ronnelid J et. al., 1997; Okamoto Y et. al., 1997）。著(zhù)名的ELISPOT塑料板當數荷蘭U-Cytech公司研發(fā)的透明板，已經(jīng)成為了該公司的一大特色。ELISPOT塑料板的重新興旺有兩個(gè)方面的原因：一方面是技術(shù)進(jìn)步，塑料材質(zhì)改進(jìn)后，板底吸附蛋白的能力已經(jīng)比傳統的塑料板有了很大提高，雖然還趕不上膜板，但已經(jīng)完全達到ELISPOT實(shí)驗對膜板材質(zhì)的要求。更高質(zhì)量的抗體也有利于塑料板獲得更好的ELISPOT結果。另一方面歸因于塑料板自身的優(yōu)勢，相對低廉的價(jià)格，簡(jiǎn)化的操作步驟，較短的實(shí)驗時(shí)間都是塑料板的優(yōu)勢（Ronnelid J et. al., 1997）。此外對于透明板，還可以在實(shí)驗中隨時(shí)觀(guān)察細胞的狀態(tài)與密度，這對新手是很重要的。

l 檢測內容的多樣化

ELISPOT技術(shù)創(chuàng )立之初，只是用于檢測B淋巴細胞分泌的抗體，包括各種類(lèi)型免疫球蛋白，包被材料是特異性抗原或者抗體的抗體（Holt PG et. al., 1984；Sedgwick JD et. al., 1984）。B細胞（尤其是分化成熟之后的漿細胞）分泌抗體的量一般比較大，容易檢測，即使早期ELISPOT檢測的靈敏度不夠高，檢測大量分泌的抗體還是不成問(wèn)題的（Bjorkander J et. al., 1991; Ahlfors E et. al., 1991; Holmgren J et. al., 1992a）。時(shí)至今日，ELISPOT檢測還廣泛地用來(lái)研究粘膜免疫中的抗體分泌情況（Holmgren J et. al., 2005）。

后來(lái)隨著(zhù)技術(shù)進(jìn)步，ELISPOT檢測靈敏度有了大幅度的提高，以至于可檢測到痕量的細胞因子，因此它的主要應用就轉移到檢測細胞因子上（Czerkinsky C et.al,. 1988a; 1991; Hutchings PR et. al., 1989）?，F在各種常見(jiàn)細胞因子的檢測都有了商業(yè)化的試劑盒，使用起來(lái)非常方面。能商業(yè)化檢測的細胞因子包括人類(lèi)、小鼠、大鼠、猴子、猩猩的干擾素（IFN-γ）、白介素（IL-2，4，5，6，10，12等）、顆粒酶（Granzyme B）、腫瘤壞死因子（TNF-α）。目前全球ELISPOT試劑盒的主要供應商有：荷蘭U-CyTech公司、瑞典Mabtech公司、法國Diaclone公司、美國BD Pharmingen公司和R&D公司。他們的產(chǎn)品各有特點(diǎn)，其中荷蘭U-CyTech公司的產(chǎn)品質(zhì)優(yōu)價(jià)廉，在國內市場(chǎng)居于主導地位。

l 預包被化

在時(shí)間寶貴，追求效率的今日，預包被化是ELISPOT技術(shù)發(fā)展的必然。作為參照，我們知道ELISA技術(shù)剛剛出現的時(shí)候，ELISA試劑盒都是未包被的，需要使用者自己臨時(shí)包被。但是時(shí)至今日，幾乎所有的ELISA產(chǎn)品都實(shí)現了預包被化。預包被是ELISPOT技術(shù)成熟的標志和在更大范圍內應用的前提。

如圖2.1所示，預包被有著(zhù)明顯的技術(shù)優(yōu)勢。PVDF板的ELISPOT試驗一共需要3天時(shí)間，采用預包被板可以節省一天的時(shí)間，當天處理細胞，當天上板檢測；未包被的檢測共有13步，預包被可以省掉其中的5步，并且這5部都是需要無(wú)菌操作的步驟，占整個(gè)無(wú)菌操作步驟的5/6。節省時(shí)間只是其一，由于減少了無(wú)菌操作的步驟，使得整個(gè)實(shí)驗污染與出錯的概率大大降低，提高了整體試驗的成功率。

綜上，ELISPOT預包被技術(shù)在產(chǎn)品中的運用可以幫助廣大實(shí)驗者解決諸多問(wèn)題。從目前的市場(chǎng)反饋情況來(lái)看，該技術(shù)在推廣過(guò)程中還需要一段磨礪。導致其推廣受限制的原因一方面來(lái)自成熟產(chǎn)品的產(chǎn)品價(jià)格，另外一方面源自實(shí)驗者的人力成本因素，在此就不詳加講述。

憑借扎實(shí)、足夠的技術(shù)儲備，加上和荷蘭U-CyTech公司深度合作，達科為公司先后推出了Quick Spot?系列預包被ELISPOT試劑盒，并于09年底在國內率先從Millipore公司引入可拆卸PVDF膜板推出預包被可拆卸試劑盒。達科為公司預包被試劑盒產(chǎn)品在2013.6月將實(shí)現全面升級，升級后產(chǎn)品價(jià)格較之現有價(jià)格沒(méi)有變動(dòng)，試劑盒配備試劑除了原有的【預包被板、檢測抗體、HRP酶、顯色底物、洗滌濃縮液、稀釋緩沖液】，更增添了陽(yáng)性刺激物！