ELISPOT實(shí)驗常見(jiàn)問(wèn)題

1． 提取外周血淋巴細胞時(shí)，有那些注意事項？ 
答：如果取外周血淋巴細胞 (PBMC) 進(jìn)行ELISPOT檢測，更好采用新鮮血液。在保證無(wú)菌操作的前提下，首先應保證取血時(shí)抗凝劑應及時(shí)充分的與血液混勻，避免血凝塊的出現?？鼓眉皶r(shí)提取PBMC，避免放置時(shí)間過(guò)長(cháng)，室溫下避免過(guò)夜。應選用分離效果好的淋巴細胞分離液，避免PBMC中混有過(guò)多其他細胞成分或雜質(zhì)。

2． 在分離外周血淋巴細胞時(shí)，發(fā)生了溶血，會(huì )影響我的試驗結果嗎？ 
答：外周血出現溶血后，在使用淋巴細胞分離液分離PBMC時(shí)，溶血產(chǎn)生的細胞碎片、血紅素等雜質(zhì)將極大可能懸浮于分離液的層面，在吸取PBMC時(shí)非常容易混入這些雜質(zhì)，由于混入細胞的細胞碎片和血紅素很難清洗去除，在進(jìn)行ELISPOT實(shí)驗時(shí)，有可能沉積在培養板底，嚴重影響細胞因子和抗體的結合，進(jìn)而影響實(shí)驗結果。

3． 采用什么方法分離外周血淋巴細胞適合于ELISPOT試驗？ 
答：使用專(zhuān)業(yè)的淋巴細胞分離液。國產(chǎn)的如：達科為公司生產(chǎn)的EZ-SepTM Human 9×（分離人PBMC）、EZ-SepTM Monkey 9×（分離猴的PBMC）、EZ-SepTM Mouse 1×（也可用來(lái)分離大鼠/兔子等的外周血淋巴細胞）；進(jìn)口的如：Optiprep、Lymphoprep等。

4． 從動(dòng)物脾臟組織分離淋巴細胞應如何操作？ 
答：取動(dòng)物脾臟組織時(shí)，應注意取材的無(wú)菌操作。分離出脾臟組織，研磨后過(guò)200目篩網(wǎng)，保證所分離的細胞為單個(gè)細胞懸液。獲得細胞懸液后應該使用相應的淋巴細胞分離液進(jìn)一步分離單個(gè)核細胞。

5． 在ELISPOT板上，每孔應該放置多少數目的淋巴細胞？ 
答：在使用ConA，PHA等陽(yáng)性刺激孔中，一般放置的淋巴細胞數為 104～2×105。在使用抗原作為刺激劑的情況下，每孔細胞濃度可在1～4×105。在使用多克隆刺激劑的情況下，應適當調低細胞濃度。但由于所用刺激劑的強度和批號不同，建議初次進(jìn)行ELISPOT檢測時(shí)，對刺激劑濃度和細胞濃度設立梯度，以保證較理想的實(shí)驗結果。

6． 對淋巴細胞進(jìn)行：體外刺激預孵育、或板內同步刺激培養應如何操作？ 
答： 將抗原和淋巴細胞在體外混合，刺激并預孵育，是通用的方法。預孵育的淋巴細胞，在置入ELISPOT板之前應使用復溫到37℃的培養液清洗細胞1-2次。置入ELISPOT板以后通常在37℃培養5～6小時(shí)。 對于高度特異性抗原，可以采用將淋巴細胞和抗原同時(shí)加入ELISPOT板孔中，37℃培養箱中，同步進(jìn)行刺激、培養、和細胞因子捕獲。淋巴細胞板內同步刺激培養的時(shí)間通常為22～24小時(shí)。

7． 在ELISPOT實(shí)驗中刺激物應如何選擇？ 
答：常用的非特異性刺激物有PMA/inomycin、PHA、Con A。根據具體的實(shí)驗選擇上稍有稍有不同，一般而言：刺激小鼠細胞用Con A或者PMA/inomycin，刺激人 PBMC多用PHA。 特異性的刺激物主要有CEF、ICE（只能用于人）等多肽或者蛋白。具體的技術(shù)問(wèn)題詳情電話(huà)垂詢(xún)。

8． 在使用抗原刺激淋巴細胞培養過(guò)程中，我發(fā)現培養液變黃，有什么影響？ 
答：這種現象通常見(jiàn)于使用很強的多克隆抗原刺激淋巴細胞，某些多克隆抗原會(huì )導致淋巴細胞凋亡或者死亡，大量淋巴細胞死亡后使培養液變黃。使用這些淋巴細胞進(jìn)行后續ELISPOT試驗通常得到很低的斑點(diǎn)（SPOT）形成。換用特異性抗原后可以避免該現象。

9． 在ELISPOT結果中出現：不規則的大塊斑點(diǎn)，有的區域沒(méi)有斑點(diǎn)是什么原因？ 
答：不規則斑點(diǎn)區域的出現一般是細胞分離不完全所至，有時(shí)候采用多克隆抗原孵育的淋巴細胞也會(huì )產(chǎn)生成團現象。請確認加入到ELISPOT板中進(jìn)行孵育的是單細胞懸液。

10.關(guān)于培養基的選擇問(wèn)題 
答：推薦使用無(wú)血清培養基（注意：是指專(zhuān)業(yè)的完全培養基，不是不含血清的1640等基本培養基）如國產(chǎn)的達科為公司的生產(chǎn)的Lympho-SpotTM 無(wú)血清培養基、進(jìn)口的荷蘭U-Cytech公司生產(chǎn)的Lympho-SpotTM serum free medium等。當然客戶(hù)也可以根據實(shí)際情況選用自備的1640培養基（含5%血清），但是血清帶來(lái)的干擾無(wú)法排除。