ELISPOT 圖像分析儀發(fā)展與展望

l ELISPOT 圖像分析儀（ELISPOT Reader）發(fā)展簡(jiǎn)史

要實(shí)現這個(gè)過(guò)程的自動(dòng)化，我們很容易想到顯微照相技術(shù)、圖像處理技術(shù)以及計算機人工智能技術(shù)。把它們綜合到一起，這就是ELISPOT圖像分析儀。1992年，德國萊卡公司推出了第一臺ELISPOT圖像分析儀。正如上世紀60年代發(fā)明的第一臺計算機占地幾百平方米，且性能低下一樣。萊卡公司推出的第一代ELISPOT圖像分析儀，僅計算機就占據一張實(shí)驗臺的位置，數據采集部分使用了復雜的電視攝像系統。這臺儀器體積龐大，效率低下。在90年代初期，ELISPOT技術(shù)并未受到重視，因而ELISPOT圖像分析儀也沒(méi)有得到推廣。不到一年時(shí)間，萊卡公司就放棄了這一產(chǎn)品。1995年，隨著(zhù)荷蘭Utrecht大學(xué)免疫研究所的Schielen P.（Schielen P et. al., 1995）首先引入PVDF膜到ELISPOT技術(shù)中，使得ELISPOT的可靠性和簡(jiǎn)便性提高，ELISPOT技術(shù)逐漸受到重視，相應的ELISPOT文獻大量涌現。眾多科研工作者迫切需要能夠自動(dòng)讀ELISPOT板的設備，因此在1995年到1997年間，出現了數家生產(chǎn)ELISPOT圖像分析儀的廠(chǎng)家。

1995年出現的ELISPOT圖像分析儀廠(chǎng)家以德國卡爾蔡司公司，德國B(niǎo)io-Sys公司，美國CTL公司，和德國AID公司為代表。對于如何識別PVDF膜板上的ELISPOT斑點(diǎn)，這些廠(chǎng)家分成兩派：1）德國卡爾蔡司公司和德國B(niǎo)io-Sys公司。這兩家生產(chǎn)商延續了德國萊卡公司的思路，依然采用顯微攝像系統來(lái)識別ELISPOT斑點(diǎn)。這種思路保持了PVDF膜板的完整性，強調對每一個(gè)孔的準確定位。2)德國AID公司和美國CTL公司。由于PVDF膜板在構造上的特殊性，PVDF膜與塑料板壁之間是可撕裂的。這兩家公司從而產(chǎn)生了新的思路：采用粘貼紙將PVDF膜粘附，再將其從塑料板壁上撕下。這樣就將識別在板上的ELISPOT斑點(diǎn)的問(wèn)題變成了識別在平面上的ELISPOT斑點(diǎn)的問(wèn)題。而識別平面上的ELISPOT斑點(diǎn)可以直接以?huà)呙鑳x來(lái)進(jìn)行。

在上個(gè)世紀90年代中期，通過(guò)掃描來(lái)進(jìn)行ELISPOT斑點(diǎn)的識別是一個(gè)重要的技術(shù)進(jìn)步。第一，掃描相對于攝像大大提高了分析速度；第二，掃描模式直接繞過(guò)了如何定位96孔板上的每一個(gè)孔的難題；第三，在價(jià)格上掃描系統只相當于攝像系統的三分之一或者更低，從而使得大多數實(shí)驗室都能夠購買(mǎi)ELISPOT圖像分析儀。但是基于掃描系統的ELISPOT圖像分析儀也有其固有的缺點(diǎn)。首先，掃描儀的分辨率非常低，隨著(zhù)ELISPOT檢測方法應用范圍迅速擴大，某些實(shí)驗中產(chǎn)生的ELISPOT斑點(diǎn)很小，掃描儀完全無(wú)法識別。雖然掃描儀本身的分辨率也在不斷提高，但和顯微攝像系統相比，始終要低1-2個(gè)數量級。其次，將PVDF膜板底部的PVDF膜撕下來(lái)掃描的做法是有其不妥之處：某些時(shí)候直接導致部分結果丟失，同時(shí)也不利于數據長(cháng)期保存。第三，其應用受限于以膜為底的ELISPOT板，當90年代末期，ELISPOT透明塑料板出現時(shí)，這種基于掃描的ELISPOT圖像分析儀在應用上大大受阻。

在ELISPOT圖像分析儀的發(fā)展史上，90年代末期出現的數碼技術(shù)是重要的技術(shù)進(jìn)步。數碼識別技術(shù)與計算機人工智能的結合使得體積小、功能強大的ELISPOT圖像分析儀成為可能。當數碼技術(shù)出現以后，德國AID公司和美國CTL公司迅速拋棄了其原有的基于掃描系統的ELISPOT圖像分析儀，重新投向以攝像系統為基礎的ELISPOT圖像分析儀。在今天的ELISPOT圖像分析儀市場(chǎng)上，ELISPOT掃描系統只剩下部分90年代的庫存產(chǎn)品。這就是技術(shù)進(jìn)步的重大力量。

由于數碼識別技術(shù)的出現，始終堅持通過(guò)顯微攝像識別ELISPOT斑點(diǎn)這一技術(shù)路線(xiàn)的德國卡爾蔡司公司和德國B(niǎo)io-Sys公司從此一直走在ELISPOT圖像分析儀市場(chǎng)的前端。在具體的技術(shù)路線(xiàn)上，兩家公司又略有不同。德國卡爾蔡司公司希望突出其高精密的顯微鏡頭，力求在成像上做到能夠識別PVDF膜上的每一個(gè)小的斑點(diǎn)。但是其缺陷也非常明顯：第一，要達到此目的，只能通過(guò)放大圖像來(lái)實(shí)現，這樣就不可能在一副圖像上包括整個(gè)完整孔底?？柌趟竟就ㄟ^(guò)軟件拼接的方法，將多幅放大圖像拼成一幅包括大部分孔底的圖像，從而實(shí)現對整個(gè)孔中的ELISPOT斑點(diǎn)進(jìn)行計數。這樣的結果是：圖像出現明顯的拼接痕跡，同時(shí)，在拼接縫部分的斑點(diǎn)識別，以及在孔邊緣的斑點(diǎn)識別也都同時(shí)成為了亟待解決確又難以解決的問(wèn)題。第二，更關(guān)鍵的是，由于ELISPOT實(shí)驗過(guò)程涉及細胞，細胞碎片、自發(fā)分泌、非特異分泌、顯色問(wèn)題等多種情況，都會(huì )在PVDF膜上留下斑點(diǎn)或者花紋。因此，ELISPOT斑點(diǎn)識別的一個(gè)關(guān)鍵的問(wèn)題是對真假斑點(diǎn)的識別。熟悉ELISPOT技術(shù)的實(shí)驗者都有共識，一個(gè)正常的ELISPOT斑點(diǎn)在大小上通常不會(huì )小于20μm。因此，關(guān)注于對小的斑點(diǎn)都能清晰識別，在生物學(xué)上并沒(méi)有太大的實(shí)際意義，反而因為增加了小斑點(diǎn)的識別影響了對真正的ELISPOT斑點(diǎn)的識別。第三，也是不可忽視的一點(diǎn)：卡爾蔡司公司的ELISPOT圖像分析儀是市場(chǎng)上價(jià)格昂貴的設備，是其他廠(chǎng)商同類(lèi)型設備的兩倍以上！

l 德國B(niǎo)yoSys公司的Bio-Reader系列

德國B(niǎo)io-Sys公司從上世紀80年代開(kāi)始就致力于生物圖像識別領(lǐng)域，在進(jìn)入ELISPOT圖像分析儀市場(chǎng)后一直以其先進(jìn)的ELISPOT斑點(diǎn)識別技術(shù)聞名。德國B(niǎo)io-Sys公司首先解決了顯微攝像系統難以定位96孔板上的每一個(gè)孔的問(wèn)題。其解決方法基于圖像識別技術(shù)，利用板孔邊壁和真正的孔底的細微差別，在機械定位的基礎上，通過(guò)軟件識別來(lái)進(jìn)一步提高每孔的定位精度。是目前市場(chǎng)上所有ELISPOT圖像分析儀中唯一能夠完整識別整個(gè)孔底ELISPOT斑點(diǎn)圖像的設備。在對真假斑點(diǎn)的分辨中，德國B(niǎo)io-Sys公司除了具備完善的物理學(xué)多參數識別技術(shù)，還特別針對ELISPOT斑點(diǎn)形成的生物學(xué)過(guò)程，通過(guò)細胞因子顯色后的“光密度”峰值積分分析方法，精確分辨真假斑點(diǎn)、融合斑點(diǎn)等復雜情況。Bioreader系列ELISPOT圖像分析儀國外大多數較有經(jīng)驗的ELISPOT實(shí)驗室推崇的特點(diǎn)為：專(zhuān)業(yè)性和參數全開(kāi)放性。因為ELISPOT實(shí)驗的復雜性，ELISPOT斑點(diǎn)形成在不同的實(shí)驗條件下有非常大的差異。這就對ELISPOT圖像分析儀提出了較高的要求：既要能夠保證斑點(diǎn)計數的真實(shí)性和一致性，又要能夠根據不同情況，通過(guò)實(shí)驗者的判斷來(lái)校正儀器對ELISPOT斑點(diǎn)識別的標準。要同時(shí)實(shí)現以上兩個(gè)要求，唯一的辦法是將儀器的所有判斷標準向ELISPOT實(shí)驗者開(kāi)放，實(shí)現實(shí)驗者和儀器的互動(dòng)。在這一方面，德國B(niǎo)io-Sys公司始終走在ELISPOT斑點(diǎn)識別領(lǐng)域的前列，新的Bioreader-4000型（圖8.3）和Bioreader -5000（圖8.4） 型在專(zhuān)業(yè)性和適用性方面都領(lǐng)先于其他廠(chǎng)家的設備。

l ELISPOT 圖像分析儀的發(fā)展和展望

近幾年，ELISPOT圖像分析儀的應用在向兩個(gè)方向發(fā)展。

第一， 作為斑點(diǎn)識別類(lèi)型的儀器，ELISPOT圖像分析儀在努力地開(kāi)辟在其它斑點(diǎn)識別領(lǐng)域的應用。

在這個(gè)方面做的較好的是德國B(niǎo)io-Sys公司的Bioreader系列。受惠于Bioreader在光源照明設計和軟件參數開(kāi)放兩方面的優(yōu)點(diǎn)，德國B(niǎo)io-Sys公司的ELISPOT圖像分析儀只需在參數上進(jìn)行調整，就可以對6孔板、24孔板、96孔板等板型上的病毒斑、溶血空斑、腫瘤細胞克隆斑等實(shí)體斑點(diǎn)或者空斑點(diǎn)進(jìn)行識別，大大擴展了儀器本身的應用。

第二， 對雙色、多色、以及熒光FluoroSpot的識別。

隨著(zhù)ELISPOT技術(shù)本身的發(fā)展，研究者不再滿(mǎn)足于現有的對單一細胞因子分泌所形成的ELISPOT斑點(diǎn)的識別。雙色或多色ELISPOT技術(shù)就此產(chǎn)生。簡(jiǎn)而言之，雙色或多色ELISPOT即檢測同一細胞同時(shí)分泌兩種或以上的細胞因子的技術(shù)。舉個(gè)例子，如果以紅色顯色劑顯示IFN-γ的分泌，以藍色顯色劑顯示IL-2的分泌，在同一個(gè)孔中，就可以通過(guò)這兩個(gè)顯色系統分辨：有多少細胞只分泌IFN-γ（紅色斑點(diǎn)），只分泌IL-2（藍色斑點(diǎn)），和同時(shí)分泌這兩種細胞因子（棕色斑點(diǎn)）。

但是，原理上很簡(jiǎn)單的雙色或多色ELISPOT技術(shù)在實(shí)際應用中遇到了很大的困擾。這就是關(guān)于混色ELISPOT斑點(diǎn)的識別問(wèn)題。具體到每個(gè)細胞，如果有兩個(gè)顯色系統同時(shí)顯色：部分紅色/部分藍色，以及其間的各種組合，都會(huì )導致不同的顏色；斑點(diǎn)的不同顯色區域，可能以紅色為主，也可能以藍色為主，無(wú)法均一定義；先分泌某種細胞因子，后分泌某種細胞因子，可能會(huì )產(chǎn)生覆蓋等諸多問(wèn)題。這些問(wèn)題都導致混色ELISPOT斑點(diǎn)難于識別。在這個(gè)方面，目前還沒(méi)有一個(gè)很好的解決辦法，從而也限制了雙色或多色ELISPOT技術(shù)的應用。從實(shí)際使用中來(lái)看，有少部分科研工作者在使用雙色ELISPOT技術(shù)，通常為探索性的研究；而多色ELISPOT技術(shù)，幾乎沒(méi)有人使用。

與之相對應，ELISPOT圖像分析儀在這個(gè)方面也只是具備基本的功能。大多數ELISPOT圖像分析儀采用RGB（紅、綠、藍）三色定義方案來(lái)識別多色斑點(diǎn)。RGB三色定義方案采用固定紅、綠、藍濾鏡，通過(guò)對一種顏色斑點(diǎn)的遮蓋來(lái)識別其他所有顏色斑點(diǎn)。從理論上講，在情況下多能夠識別三色斑點(diǎn)的ELISPOT。但實(shí)際應用中，顯色系統的不同實(shí)驗條件會(huì )導致不同的顏色。比如：AEC顯色系統從理論上為標準紅色，但實(shí)際上根據實(shí)驗條件的不同，其顯色從橙黃到正紅到紫紅。其他顯色系統也有類(lèi)似的問(wèn)題。如果兩種或以上顯色系統共同作用，其混色斑點(diǎn)的顏色千變萬(wàn)化，絕對不是簡(jiǎn)單用紅、綠、藍三色固定濾鏡能夠分辨的。如何解決這個(gè)問(wèn)題，只有在顏色定義方案上下功夫，在這個(gè)方面，德國B(niǎo)io-Sys公司的顏色解決方案相對較好。德國B(niǎo)io-Sys公司采用HLS（色度、亮度、飽和度）這一國際新的顏色定義方案，理論上可自定義十萬(wàn)種以上顏色，用于濾鏡識別。在針對單色顯色系統和多色顯色系統因各種原因導致非標準顏色的識別上相對準確。當然該系統也有其自身的不足：對于斑點(diǎn)與斑點(diǎn)之間、孔與孔之間、板與板之間的顏色變化，不能自動(dòng)適應，自動(dòng)調節。對于顏色自動(dòng)識別，這是一個(gè)普遍的難題，目前沒(méi)有一種技術(shù)能夠做到。

ELISPOT技術(shù)如果需要向多細胞因子檢測的方向發(fā)展，就必須解決多顯色系統同時(shí)顯色的問(wèn)題。既然混色識別是一個(gè)難以跨越的難題，一些ELISPOT試劑生產(chǎn)商自然向熒光顯色方向發(fā)展，這就是熒光耦聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)（FluoroSpot）。由于采用熒光發(fā)光標記，而不是顯色劑沉淀顯色，熒光耦聯(lián)免疫斑點(diǎn)（FluoroSpot）從誕生之日起，就天然的解決了多系統同時(shí)顯色的問(wèn)題。同時(shí)由于熒光發(fā)射光波長(cháng)具有唯一性，其顏色不因實(shí)驗條件的變化而變化。FluoroSpot從2005年出現以來(lái)，在敏感性、特異性等方面已經(jīng)達到或超過(guò)ELISPOT，目前更大的難題在于長(cháng)期保存的問(wèn)題，限制了其商業(yè)化進(jìn)程。但是，FluoroSpot作為多細胞因子檢測的必然發(fā)展方向，已經(jīng)在ELISPOT領(lǐng)域的科學(xué)工作者中達到共識。與之相配合，熒光耦聯(lián)免疫斑點(diǎn)（FluoroSpot）圖像分析儀也在2005年底首先由德國B(niǎo)io-Sys公司正式推出市場(chǎng)，并在加拿大實(shí)現全世界首臺FluoroSpot圖像分析儀的銷(xiāo)售和應用。

我們可以預測，隨著(zhù)FluoroSpot技術(shù)的成熟和FluoroSpot圖像分析儀的成熟，FluoroSpot必然逐漸取代目前的ELISPOT技術(shù)，并使得免疫斑點(diǎn)技術(shù)真正成為以高通量、多因子、高靈敏、和高穩定性為特征的細胞免疫檢測技術(shù)。而免疫斑點(diǎn)圖像分析儀的不斷發(fā)展也大力地推動(dòng)了該技術(shù)在免疫學(xué)、病毒學(xué)、腫瘤學(xué)、以及臨床檢測中的廣泛應用。