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    一種快速高通量檢測轉錄因子活性的新方法--告別實(shí)驗室苦力

    作者:admin 信息來(lái)源:達科為 日期:20210827 打印 字體:  
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    轉錄因子通過(guò)與DNA結合來(lái)調節基因表達,從而控制細胞分裂、代謝、凋亡和DNA修復等重要過(guò)程。因為它們可以控制改變細胞內基因表達,所以轉錄因子是研究人員非常感興趣的。研究蛋白質(zhì)-DNA相互作用的科學(xué)家經(jīng)常依賴(lài)于WB或電泳遷移實(shí)驗(EMSAs),這種方法基于蛋白質(zhì)-DNA復合物和非復合物DNA在非變性條件下電泳遷移的相對差異,這些實(shí)驗方法步驟較多,耗時(shí)較長(cháng),通常需要放射性標記的探針?;诖?,Genie公司發(fā)布了一種基于96孔板比色法的實(shí)驗產(chǎn)品,在該方法中,感興趣的TF首先與包被在板底的含有蛋白結合共識序列的寡核苷酸結合,孵育識別TF抗體后,通過(guò)酶顯色方法來(lái)確定轉錄因子的活性。
     

     

     

    比色法試劑盒與傳統的方法對比 
     

    從CHO-1細胞和經(jīng)過(guò)PMA(可以誘導AP-1 TF的活性)處理的CHO-1細胞中獲取核提取物,利用傳統的凝膠遷移方法和比色法同時(shí)檢測,凝膠位移分析顯示TF-DNA復合物的形成,通過(guò)放射性標記的DNA遷移率的變化來(lái)證明,但確定經(jīng)處理和未處理的提取液之間的帶強度差異是有一定困難的(圖a)。相比之下,用比色法試劑盒檢測結果可發(fā)現不同處理組之間的差異非常清晰(圖b)。
     

     

     比色法試劑盒的應用 
     

    通過(guò)加入刺激劑或抑制劑來(lái)評價(jià)TF結合能力的差異是比色法試劑盒的一個(gè)特征。這個(gè)特點(diǎn)可以用于藥物快速高通量的篩選。不同濃度的TNF-α激活NF-κB p65,分別用200 ng/ml TNFα和50 ng/ml TNFα處理HeLa細胞30分鐘和120分鐘后,制備核提取物,然后評估NF-κB TF與其共識序列結合的相對變化。在低濃度時(shí),TNFα使NF-κB活性增加了27倍以上,而在高濃度時(shí),TNFα使NF-κB活性增加了50倍以上(圖a所示)。

     

    同樣,通過(guò)測量了COS-7細胞中缺氧誘導因子-1α (HIF-1α)的激活。HIF-1α TF與腫瘤進(jìn)展有關(guān),通過(guò)泛素化途徑抑制進(jìn)展的治療使其穩定。2,2-dipyridyl是一種鐵螯合劑,可防止HIF-1α泛素化。用2,2-dipyridyl處理COS-7細胞17 h后,制備核提取物,然后測定HIF-1α TF與其一致序列的結合。與未處理的細胞相比,2,2-dipyridyl處理17 h后COS-7細胞的HIF-1α TF結合DNA的能力增加了3倍以上(圖b)。
     

     

    Genie Transcription Factor Activity Kit(比色法)特點(diǎn)

     

    01、選擇靈活性:細胞&核裂解物,磷酸化轉錄因子或者WT轉錄因子

     

    02、操作簡(jiǎn)單:整個(gè)孵育過(guò)程只需5h左右

     

    03、快速篩選:轉錄因子抑制劑或激活劑的高通量篩選

     

    04、特異性高:高度驗證的抗檢測有活性的TF,排除與相近TF家族成員發(fā)生交叉反應

     

    05、指標豐富:可提供數以百計的指標。

     

    Genie廠(chǎng)家生產(chǎn)的Transcription Factor Activity Kit試劑盒提供了一種快速、高效及高靈敏度的檢測方法來(lái)評價(jià)轉錄因子結合與其相對應的DNA的能力。該系列試劑盒通過(guò)了多種類(lèi)型實(shí)驗驗證,數據穩定可靠,使用簡(jiǎn)單快捷,可有效地將研究人員從繁重的實(shí)驗室勞動(dòng)中解放出來(lái)。

     

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