AAT熒光染料標記蛋白常見(jiàn)問(wèn)題解答

AAT熒光染料相關(guān)問(wèn)題

1、AAT熒光染料與傳統染料相比有何優(yōu)勢？

iFluor系列染料與傳統染料如 Cy3 Cy5 Cy7（from GE）相比水溶性好穩定性高PH不敏感、亮度高、價(jià)格低、背景值低，可以完美替代。

2、抗體標記的原理是什么？

對于iFluor系列的 SE（琥珀酰亞胺酯）染料，SE與抗體的氨基反應生產(chǎn)穩定的酰胺鍵；而對于A(yíng)PC、PE、HRP等大蛋白分子，預活化好的FOL的大蛋白，與需要連接在抗體上的MTA特異性結合。

3、標記好的抗體4度條件下可以?xún)Υ娑嗑茫?/span>

標記好的抗體當濃度大于等于1mg/ml，4度可儲存一年，當抗體濃度在0.1-0.5mg/ml時(shí)，可以加入0.2%BSA保存。

4、染料的保質(zhì)期是多久？

在產(chǎn)品備注的儲存溫度條件下，以開(kāi)封日起可存放一年。PS:DMSO 溶液不是很穩定，需要無(wú)水 DMSO，避免凍融循環(huán)。

5、標記的抗體或者蛋白大小有要求嗎？

建議不要小于20KD

6、有哪些抗體不適合用于標記？

不適合包含牛白蛋白血清（BSA），明膠，游離氨基酸(L-組氨酸)或銨鹽的抗體或蛋白質(zhì)。

7、去除疊氮化鈉、硫酸銨或醋酸銨等這些雜質(zhì)成分用什么？

只需要Cat#60502 spin filter一個(gè)柱子可去掉所有的這些雜質(zhì)。

8、在標記大蛋白使用的MTA，必須搭配使用MTA清除劑使用嗎？

可以不用，因為這個(gè)group細胞里是沒(méi)有的。

9、 一抗抗體上可以結合幾個(gè)熒光素？不同抗體會(huì )不會(huì )鏈接上的熒光數量不同？

相同條件不會(huì )連的熒光數量不同，一般在2-4之間，不同的熒光染料略有不同。DOS＞４以后亮度增加不多，會(huì )更亮一些，但背景值可能會(huì )增加。對于不易淬滅的熒光可以標記到6。

10、標記的效率如何檢測？

iFluor 的標記我們是測純化后的dye/protein ratio，也有客戶(hù)用 Run SDS Gel的方法。

Buccutite的效率我們是用SEC的column來(lái)測的。

11、iFluor系列染料標記蛋白會(huì )不會(huì )影響被標記蛋白和別的蛋白的相互作用？

不會(huì )

12、AAT市售的抗體不同應用的抗體推薦稀釋比是多少？

Western Blot (WB): 1μg/ml，Immunofluorescence (IF): 2-10 μg/mL ，Flow Cytometry (Flow):  2-10 μg/mL

13、用AAT熒光標記的抗體更亮的原因是什么？

結構不同，在于熒光做了修飾，容易鏈接到抗體上而不易發(fā)生淬滅，比如一個(gè)抗體IF594能標4-6個(gè)，而AF594只有2-3個(gè)。

14、染料和蛋白的比例大概是多少？

大約摩爾比為1：15，在抗體濃度是1mg/ml時(shí)。

15、最常見(jiàn)的succinimidyl ester（琥珀酰亞胺酯）和Maleimide活性集團結合在抗體的什么部位？

SE跟抗體的-NH2連接形成類(lèi)似于肽鍵的結構，從而連接到抗體上，這是最簡(jiǎn)便的連接方式；Maleimide活性基團與巰基（-SH）結合，優(yōu)點(diǎn)是只標記抗體Fc片段不會(huì )影響抗原抗體的結合部位。

16、抗體標記DPR值(抗體和熒光蛋白的比例)的參考范圍有沒(méi)有推薦？

這個(gè)與抗體和dye的比例有關(guān)，也與抗體的濃度有關(guān)，請參考不同染料的說(shuō)明書(shū)，里面有建議的比例。

17、標記過(guò)后用什么柱子純化？

貨號為60500的柱子純化。

18、AAT iFluor熒光染料是否有自己的專(zhuān)利？我使用iFluor在自己的產(chǎn)品上時(shí)是否需要支付版權費用？

我們可以提供專(zhuān)利證明文件。從達科為購買(mǎi)AAT熒光染料，無(wú)需支付版權費。

19、MTA和FOL組合與SMCC標記大蛋白方法的最大優(yōu)勢是什么？

交聯(lián)劑的一端（通過(guò)NHS酯）與氨基酸賴(lài)氨酸和N-末端中發(fā)現的胺（-NH2）反應，另一端（通過(guò)馬來(lái)酰亞胺）與氨基酸中發(fā)現的硫醇基團（-SH）反應半胱氨酸。然而，SMCC修飾的蛋白質(zhì)極不穩定并且通常是自身反應性的，因為蛋白質(zhì)通常含有胺和硫醇基團，其引起顯著(zhù)量的自交聯(lián)。

操作簡(jiǎn)單的抗體標記試劑盒問(wèn)題

20、我的抗體中含有甘油可以用抗體標記試劑盒嗎？

甘油最好20% 以下

21、iFluor系列抗體標記試劑盒中的淬滅劑為什么可以淬滅掉沒(méi)連接在抗體上的熒光，而標記在抗體上的熒光卻不會(huì )被淬滅？

因為淬滅劑和未結合上的熒光是分子內的淬滅，而連在抗體上的熒光，是分子間的淬滅，只有很高濃度才會(huì )被淬滅。

22、抗體標記試劑盒的淬滅劑的成分是什么，可以單獨購買(mǎi)嗎？

淬滅劑是一種小分子，可以單獨購買(mǎi)，貨號為“標記試劑盒貨號+C”，例如1255C。

23、抗體標記試劑盒的淬滅劑可以淬滅APC、PE 這種大蛋白嗎？

不推薦，建議使用60500柱子純化。

24、我要做體內實(shí)驗擔心抗體標記試劑盒中的淬滅劑會(huì )影響實(shí)驗怎么辦。

1）不加淬滅劑，加10mM Glycine buffer 可以， 這樣dye 就沒(méi)有活性了。

2）可以用10K filter把小分子的dye 除去。

 https://www.aatbio.com/products/readiuse-10kd-spin-filter?unit=60502

25、iFluor系列染料和Buccutite試劑盒，標記蛋白或抗體的效率分別是多少呢？

iFluor 的標記是全標記上了，但是Buccutite的效率應該在80%以上。

26、Readlink試劑盒的reaction buffer成分是什么？

可以用1.0M NaHCO3 buffer or Phosphate buffer (pH=8.5)來(lái)調pH

27、iFluor系列抗體標記盒，我每次標記不了50ug，每次標記可不可以小于50ug？

可以小于50ug, dye用DMSO溶，等比例減少用量， 但是剩下的dye量很少，可能不太穩定。

28、如果我的抗體含有少量的BSA，是否可以使用抗體標記試劑盒？

可以，我們有BSA兼容的ReadiLink? xtra 系列抗體標記試劑盒，但是BSA的含量要在0.5%以?xún)鹊臉擞浶Ч亲詈玫摹?/span>

 番 外：

1. 關(guān)于60502 這個(gè)產(chǎn)品的用法很靈活，主要有以下三方面的用途：

1）Concentrate volume （濃縮）

2）Desalting （除鹽，或除去小分子）

3）Deproteinization of biological samples （除蛋白）

從第二個(gè)用途來(lái)說(shuō)和60500柱的用途是一樣的。但是推薦用60500，會(huì )除小分子更快更干凈一些。

2. 標記大蛋白SMCC方法簡(jiǎn)要步驟： APC/SMCC和抗體/DTT分別過(guò)柱子,混合,封閉,濃縮,檢測。APC在標記前需要過(guò)柱子成PBS緩沖液；SMCC現用現配。

3. IgG的大小是150Kd

4.不同染料對比數據

5. 不同染料基本信息

6. 工業(yè)客戶(hù)推薦簡(jiǎn)要的“原汁原味”P(pán)rotocol實(shí)例

1) iFluor594, NHS, 1mg/vial, add 100uL anhydrous DMSO to prepare 10mg/ml solution.

2) Prepare Antibody 5mg/ml in PBS, 100uL

3) Add  5ul 1.0M NaHCO3 (pH=8.5-9.0) to adjust pH to 8.5-9.0

4) Add 3.9uL 10mg/ml  iFluor594, SE stock solution (10X labeling ratio)

5) Mix well, incubate at room temperature for 60min

6) Set up Spin column (Cat#60500), equilibrate column with PBS buffer

7) Collect elution

8) Measure Absorbance A280nm  and A594nm

https://www.aatbio.com/tools/degree-of-labeling-calculator

Target DOS >4

9) If DOS is lower than 4, need to add iFluor594, SE and relabel the conjugate until it reaches the target DOS.

7. 10mg/ml 每次標記20mg抗體實(shí)例

1) 10mg/ml in PBS, 2mL, Add 100uL reaction buffer to adjust pH

2) Dissolve iFluor488, SE in DMSO to make 10mg/ml

3) Add 8 eq. mole iFluor488, SE to IgG solution

4) Reaction for 60min

5) Pack 2 PD-10 columns (10mL gel/column)

6) Load 1mL reaction mixture,

7) Spin to purify the mixture

8) Collect the purified IgG-iF488 conjugate.

PD-10珠子的材料是聚丙烯酰胺，建議純化1500以下的小分子與分子量大于15，000以上的蛋白。