ChIP實(shí)驗Tips匯總（上），來(lái)自英國ChIP實(shí)驗專(zhuān)家Chromatrap?的分享

ChIP是一種發(fā)展很快的研究技術(shù)，主要應用于確定細胞內DNA與蛋白質(zhì)的相互作用，這一點(diǎn)對正確的基因調控尤為重要。ChIP在表觀(guān)遺傳學(xué)領(lǐng)域正被逐漸應用于藥物研發(fā)中的分子機制研究、分層醫學(xué)、診斷學(xué)以及將ChIP與第二代測序相結合的ChIP-seq技術(shù)中。

當您在為遇到上述的問(wèn)題食不知味、夜不能寐、山重水復疑無(wú)路時(shí)，不妨看看英國ChIP實(shí)驗專(zhuān)家Chromatrap?提供的Top 10 tips錦囊，或許能柳暗花明又一村！

一個(gè)成功的ChIP實(shí)驗很大程度上依賴(lài)于所制備的染色質(zhì)的質(zhì)量。染色質(zhì)制備 重要的三個(gè)方面包括：裂解、交聯(lián)、片段化。每一個(gè)步驟都應該被獨立地優(yōu)化以合適地還原所研究的生物過(guò)程。請閱讀以下在染色質(zhì)制備中的相關(guān)技巧。

染色質(zhì)在室溫保存或處理時(shí)極易被降解，且速度非?？?。為了防止染色質(zhì)的快速降解以及獲得具有良好可重復性的結果，保證在整個(gè)實(shí)驗過(guò)程中染色質(zhì)一直處于冰上。盡量避免反復凍融，制備完成后獨立分裝到小管中保存，可以幫助防止染色質(zhì)的降解。在Chromatrap?提供的試劑盒中，每個(gè)IP所需要的染色質(zhì)是極小量的，因此每一個(gè)獨立分裝的小管樣品可以提供多次ChIP實(shí)驗所需的染色質(zhì)量。

正如上述提到的，染色質(zhì)的質(zhì)量在得到一個(gè)好的ChIP結果中起著(zhù)關(guān)鍵性作用。為了保證較好的染色質(zhì)的質(zhì)量，細胞的交聯(lián)條件需要被不斷優(yōu)化。避免過(guò)度交聯(lián)細胞這一點(diǎn)尤為重要，因為這會(huì )導致細胞耐受后續的裂解和超聲片段化。過(guò)度交聯(lián)細胞也會(huì )影響反交聯(lián)的效率（即交聯(lián)效果不能被有效地去除），這會(huì )影響后續的實(shí)驗過(guò)程（例如qPCR）。

Chromatrap?推薦使用1%的甲醛于培養基或PBS中交聯(lián)細胞，在室溫條件下于旋轉混勻器上交聯(lián)10分鐘即可。如果效果依舊不佳，可嘗試將交聯(lián)時(shí)間減少至5分鐘。

交聯(lián)細胞這一過(guò)程會(huì )影響所制備的染色質(zhì)的質(zhì)量從而影響整個(gè)ChIP實(shí)驗。確保每次制備染色體的過(guò)程中使用的甲醛都是現配現用的，這也可以保證實(shí)驗結果具有更好的可重復性。確保甲醛中沒(méi)有甲醇的污染，因為甲醇可以破壞細胞膜從而改變交聯(lián)條件。

染色質(zhì)可以通過(guò)超聲處理（超聲波機械斷裂）或者酶解（微球菌核酸酶消化）的方式片段化。根據細胞的不同選擇合適的片段化方式是十分重要的。Chromatrap?可以依據片段化方法的不同提供相應的試劑盒。我們也可以提供酶解片段化的優(yōu)化試劑盒。

在無(wú)法使用超聲處理或者為了盡可能減少對可被特異抗體識別的蛋白抗原表位的破壞的情況下，酶解片段化方法十分有效。然而，這種方法具有一定的偏好性，因為核酸酶具有切割特定基因序列的特性。酶解片段化主要應用于非交聯(lián)染色質(zhì)免疫沉淀（Native ChIP）實(shí)驗，在這個(gè)過(guò)程中，染色質(zhì)與蛋白質(zhì)并沒(méi)有被交聯(lián)，這時(shí)如果采用超聲處理來(lái)片段化染色質(zhì)將破壞染色質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用形成的復合物。一些細胞種類(lèi)也許耐受裂解從而導致較差的酶解片段化效率，在這種情況下可以嘗試超聲處理來(lái)同時(shí)幫助細胞的裂解以及染色質(zhì)的片段化。

以下列出了超聲處理以及酶解片段化的優(yōu)缺點(diǎn)，供您優(yōu)化片段化過(guò)程中參考從而提高效率。