如何做好逆轉錄PCR（一）——影響逆轉錄的重要因素

逆轉錄PCR （ RT-PCR ）

逆轉錄PCR (RT-PCR )具有靈敏性高、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，常用于基因定量分析、生物學(xué)檢測和克隆特定基因的cDNA序列等方面。

cDNA的合成是RT-PCR 的重要環(huán)節。以mRNA為模板，在逆轉錄酶的催化下，隨機引物、oligo(dT)或基因特異性引物的引導下合成互補的DNA(complementary DNA，cDNA)，再按照普通PCR的方法設計兩條引物，以cDNA為模板，則可擴增出不含內含子的完整基因的序列。

逆轉錄PCR 的重要因素

不同的mRNA轉錄成cDNA的效率不同，適合某一種mRNA轉錄的條件可能對另一種mRNA不適合，因此，在進(jìn)行不均一mRNA反轉錄時(shí)，下面的參數非常重要。

一、逆轉錄酶

常見(jiàn)的逆轉錄酶有四大類(lèi)：

• 第一種來(lái)自純化的禽成髓細胞瘤病毒(AMV)，由兩條肽鏈組成，具有聚合酶活性和很強的RNase H活性，它最適溫度是42℃，最適pH8.3。在高反應溫度時(shí)可消除mRNA的二級結構對逆轉錄的阻礙，因此適合用來(lái)擴增比較復雜的模板，但是由于A(yíng)MV具有高水平的RNase H的活性，RNaseH同反轉錄酶相互競爭RNA模板與DNA引物或cDNA延伸鏈間形成的雜合鏈，并降解RNA（RNase H可特異性消化DNA-RNA雜合鏈中的RNA），被降解的RNA模板不能再作為合成cDNA的有效底物，所以AMV不適合太長(cháng)片段cDNA的合成。

• 第二種來(lái)源于鼠白血病病毒(MMLV)，它是單肽鏈的，有RNA聚合酶活性和相對較弱的RNase H活性。該酶最適反應溫度為37℃，最適pH為7.6。由于具有較弱的RNase H活性，因此使用該酶能得到較長(cháng)的cDNA片段（2-3kb），但是MMLV對熱的穩定性差。

• 第三種來(lái)自Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜熱微生物的熱穩定性反轉錄酶，在Mn²⁺存在下，可以高溫進(jìn)行反轉錄，以消除RNA模板的二級結構。

• 第四種是MMLV反轉錄酶的RNaseH-突變體，此種酶與其它酶相比，能更多的將RNA轉錄成cDNA。這一特性使得研究者能從含二級結構的、低溫反轉錄很困難的mRNA模板中合成較長(cháng)的cDNA。

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EpiScript? Reverse RNase H- Transcriptase（Cat# ERT12925K，Lucigen）

1. 是一種重組的MMLV反轉錄酶，降低了RNase H的活性；

2. 該酶能夠高效的從長(cháng)的RNA模板合成全長(cháng)cDNA；

3. 比其他MMLV逆轉錄酶具有明顯高的活性；

4. 該酶能夠從低至50 pg的總RNA中合成cDNA；

5. 試劑盒中含有10X RT Reaction Buffer和100mM DTT；

二、合成 cDNA的引物

合成cDNA的引物一般分為三大類(lèi)：

• 隨機引物：某些特定mRNA由于含有使反轉錄酶終止的序列，比較難以轉錄成全長(cháng)序列時(shí)，可采用非特異的隨機引物來(lái)轉錄全長(cháng)mRNA。選擇這種引物，體系中所有RNA分子會(huì )全部充當DNA第一鏈模板，然后PCR引物在下游擴增過(guò)程中再擴增特異的目的基因。通常，用此引物合成的cDNA中，96%來(lái)源于rRNA。

• Oligo(dT)：絕大多數真核細胞的mRNA具有3’端Poly(A+)尾，所以使用Oligo(dT)僅mRNA可被轉錄。由于Poly(A+)RNA僅占總RNA的1-4%，所以用這種引物合成的cDNA比隨機引物得到的cDNA量少、復雜性小。

• 特異性引物：以目標RNA互補序列的寡核苷酸作為引物，用此類(lèi)引物僅生成所需要的cDNA，產(chǎn)生PCR產(chǎn)物更為特異。

三、緩沖液及dNTPs

緩沖液中的離子濃度會(huì )影響各種模板的轉錄效率。一般情況下，用鉀離子比用鈉離子可獲得較長(cháng)的轉錄產(chǎn)物。另外，使用高濃度、高純度的四種脫氧核苷三磷酸(dNTP)對于有效合成cDNA也是特別重要的。

逆轉錄PCR選擇一步法還是兩步法？

RT-PCR 的實(shí)驗操作分為“一步法”與“兩步法”兩種：

一步法RT-PCR 能克隆微量mRNA而不需合成cDNA，省略了cDNA與PCR之間的過(guò)程。兩步法RT-PCR首先用反轉錄酶合成cDNA，然后以cDNA為模板進(jìn)行PCR，即RNA 反轉錄與PCR 擴增分兩步進(jìn)行。

一步法RT-PCR與兩步法相比快速、簡(jiǎn)便、減少了污染機會(huì )、減少了RNA二級結構、減少了PCR 反應的錯配率。兩步法RT-PCR的優(yōu)勢在于可獲得中間產(chǎn)物cDNA，便于保存；且第二步PCR只需取逆轉錄反應產(chǎn)物的1/10進(jìn)行反應，有利于PCR條件的調整，便于重復試驗；兩步法可以在第二步PCR反應體系中加入特異性引物，其靈敏度比一步法高；兩步法的實(shí)驗預算要低于一步法。但是由于兩步法包括第一鏈cDNA合成和隨后的PCR反應，容易產(chǎn)生污染問(wèn)題。

下一篇我們將分享逆轉錄PCR實(shí)驗過(guò)程中注意的問(wèn)題與解決方案，敬請期待哦~

達科為逆轉錄PCR優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品推薦（一）

美國Lucigen公司成立于1998年，提供各類(lèi)用于分子生物學(xué)相關(guān)產(chǎn)品，可以使研究者成功克隆較難克隆的基因，其在2016年收購了Illumina旗下Epicentre產(chǎn)品線(xiàn)。目前產(chǎn)品類(lèi)別主要包括：體外轉錄、基因克?。?/span>BAC克隆試劑盒）、感受態(tài)細胞（TG1噬菌體文庫構建感受態(tài)）、體外擴增、轉座子突變、蛋白表達、文庫構建等。