流式細胞術(shù)之補償調節

流式細胞儀是通過(guò)內置的激光器發(fā)射激光激發(fā)熒光染料，即被488nm或其它特定波長(cháng)的光激發(fā)后，發(fā)射出另一特定波長(cháng)的發(fā)射光，并通過(guò)光電倍增管或光電二極管將光信號放大轉變?yōu)殡娦盘柣驍底中盘?，并由計算機統計處理為可讀數據。

用激光束激發(fā)兩種或兩種以上熒光染料而發(fā)出不同波長(cháng)的熒光，從理論上講，可以選擇光學(xué)組件將它們分開(kāi)，僅使一種熒光被一種熒光探測器收集處理，而檢測不到另外一種熒光。但實(shí)際上由于熒光素的發(fā)射波長(cháng)是正態(tài)或偏正態(tài)曲線(xiàn)，即有很寬的范圍，熒光素之間的波譜常有重疊現象，如下圖1-1所示。由此，我們需要進(jìn)行補償調節，補償的強度將隨著(zhù)各熒光探測器的放大倍數（電壓）的變化而變化，特定的電壓對應特定的補償參數。

圖1-1  FITC和PE發(fā)射光譜

對于熒光補償的確定，需運用以上補償的基本原理并結合特定的標本來(lái)實(shí)現。以FITC,PE雙色分析為例：

（1）先調節陰性對照管：將原補償清零，首先調節電壓，通過(guò)調節電壓，使陰性群落在FITC和PE雙陰性區。

（2）FITC單染管：在理想情況下（沒(méi)有熒光干擾），因檢測管中不應該出現PE信號，但實(shí)際情況是在FITC與PE的雙陽(yáng)性區出現了熒光信號。這個(gè)信號就是PE探測器檢測到的FITC信號。此時(shí)需要通過(guò)調節補償參數，取合適的補償強度來(lái)抵消PE中的信號。如下圖所示，調節補償（PE- %FITC ),使得兩群細胞FL2的Mean/Median值相同或相近，或通過(guò)經(jīng)驗判斷（原則為“橫平，豎直”）。當PE探測器檢測到的FITC信號恰好完全消除時(shí)，即PE信號與陰性對照一樣時(shí)，PE對FITC的補償調節完成。

（3）PE單染管：同理，將進(jìn)入FITC探測器的PE信號通過(guò)補償調節來(lái)消除。 

（4）當設置好以上補償條件后，即補償調節完畢。

圖1-2 FITC和PE通道補償調節

圖1-3 補償不足和過(guò)補償的雙參數點(diǎn)圖

補償調節抗體的正確選擇對于熒光通道之間的補償調節是非常重要的。要求選擇的抗體所結合的抗原分子在樣本細胞中有明確表達，占樣品細胞的10%以上，50%以下。如果陽(yáng)性細胞比例太低，在陽(yáng)性細胞區域無(wú)法形成明顯的細胞團，無(wú)法判斷調節是否合適。如陽(yáng)性細胞比例過(guò)高，則不表達該抗原的陰性細胞無(wú)法形成明顯的細胞團，如圖1-4直方圖所示。

圖1-4直方圖

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