內毒素對ELISPOT檢測的干擾

l 背景知識

我們都知道，內毒素的化學(xué)本質(zhì)是革蘭氏陰性細菌的脂多糖。它可以激活免疫細胞的受體TLR4 (Toll like receptor4)和TLR2，從而引發(fā)免疫細胞內一系列的反應，包括產(chǎn)生一系列細胞因子，從而啟動(dòng)先天免疫應答（Poltorak, A. et. al., 1998）。

實(shí)際上，內毒素只是一大類(lèi)能通過(guò)TLR受體家族激活先天免疫系統的供體中的一種。其它的供體還包括細菌共有的Lipopetide、脂蛋白（Lipoprotein）、鞭毛蛋白（Flagellin）（vison, S. M et. al., 2007）；革蘭氏陰性菌的多聚甘露糖醛酸（Mannuronic acid polymer）、非典型脂多糖（Atypical lipopolysaccharide）、外膜脂蛋白A、膜孔道蛋白（Porin）、外膜蛋白A（Outer membrane protein A）、菌體糖脂質(zhì)（Glycolipid）、菌毛蛋白A（CsgA）；革蘭氏陽(yáng)性菌的肽聚糖、磷壁酸；分枝桿菌中特有的三乙?；鞍祝?/span>Triacetylated lipoprotein）、二乙?；模?/span>Diacetylated lipopeptide）、脂阿拉伯甘露糖（Lipoarabinomannan）、結核分支桿菌的結核素（STF）；支原體的二乙?；?；錐蟲(chóng)的糖肌醇磷脂（Glycoinositolphospholipids），弓形蟲(chóng)的Profilin-like protein；真菌的酵母聚糖；病毒的未甲基化CpG DNA、 ssRNA、 dsRNA，某些病毒的膜蛋白與膜融合蛋白。

這些外源病原性的供體刺激TLR受體家族之后，共有4條信號通路，包括：1依賴(lài)于MyD88（骨髓分化基因）信號通路，這是主要通路；2不依賴(lài)于MyD88信號通路；3Small GTPase信號通路；4PIP信號通路。四條通路也相互偶聯(lián)成網(wǎng)，激活后面的效應途徑，包括有絲分裂原激活的蛋白激酶途徑（mitogen-activated protein kinase, MAPK）和NF-κB途徑等等（Oda, K et. al., 2006）。

一旦這些非特異性細胞免疫途徑激活，作為檢測特異性細胞免疫的ELISPOT檢測必然會(huì )受到干擾。屆時(shí)，我們將無(wú)法區別哪些斑點(diǎn)是特異性抗原刺激產(chǎn)生的，哪些是非特異性的細胞免疫反應產(chǎn)生的。所以，增加ELISPOT檢測可信度，提高檢測重復性的一個(gè)重要環(huán)節就是要嚴格控制好以?xún)榷舅貫槭椎目赡芨蓴_ELISPOT檢測的各種TLR供體。

l 應對措施

實(shí)際實(shí)驗中，最容易出現的TLR供體干擾來(lái)源是微生物的污染，包括細菌、真菌和酵母。為了盡可能避免內毒素對實(shí)驗結果產(chǎn)生的干擾，重點(diǎn)要做好以下幾個(gè)方面：

 1選擇高品質(zhì)的ELISPOT試劑盒，試劑盒內的成分應該盡量完整。我們推薦達科為/U-Cytech公司的產(chǎn)品。該產(chǎn)品的質(zhì)量已為國內客戶(hù)多年的使用所證實(shí)，并且試劑盒內的各種成分非常齊備，除客戶(hù)必須自備的Milli Q和PBS之外，客戶(hù)不需要自行準備其它試劑，避免了引入各種TLR供體而干擾實(shí)驗。

作為對比，BD公司和Diaclone公司的ELISPOT試劑需要客戶(hù)自行準備封閉液以及抗體稀釋液，Mabtech公司更是只提供抗體對。特別指出：自行準備的封閉液，封閉之后會(huì )直接接觸檢測細胞，引入受污染的微生物或者內毒素是很普遍的。這就會(huì )導致背景變臟，負對照產(chǎn)生額外的斑點(diǎn)，并且實(shí)驗孔中特異性的斑點(diǎn)與非特異性的斑點(diǎn)混雜，最終影響整個(gè)實(shí)驗的重復性與可信度。

ELISPOT檢測中，無(wú)菌操作部分需要的各種溶液應該在潔凈的空間內（比如超凈臺內）配制，盡量采用過(guò)濾除菌的方式。以未包被ELISPOT試劑為例，需要保持嚴格潔凈的溶液有：潤濕PVDF膜的酒精、洗滌用超純水或者PBS、包被抗體以及抗體稀釋液、封閉液、培養基、刺激物。

在潔凈的空間內配制可以有效避免灰塵以及其它污染物。采用過(guò)濾除菌可以有效濾除菌體，如果用高壓滅菌，容易引起生物活性成分失活，而且死亡的菌體反而會(huì )釋放出更多的TLR供體成分。

使用無(wú)內毒素的各種耗材、器皿。有些實(shí)驗室習慣于使用一次性塑料耗材培養細胞或者做實(shí)驗，這些耗材確實(shí)使用方便，并且能避免污染。但對于ELISPOT檢測而言，最好選用已經(jīng)表明不含熱源的品牌。如果使用可重復使用的玻璃器皿，注意嚴格浸泡洗液，嚴格清洗。內毒素或者某些TLR供體的化學(xué)性質(zhì)非常穩定，只有在濃硫酸/重鉻酸鉀的洗液中或者170°C烘烤4小時(shí)才會(huì )完全分解。

使用高質(zhì)量的刺激物。

使用達優(yōu)?無(wú)血清培養基。

嚴格的無(wú)菌操作。

總之，內毒素以及其它TLR供體是ELISPOT檢測中一大類(lèi)干擾源。它們并不會(huì )導致ELISPOT檢測的完全失敗，故初學(xué)者這些干擾源不會(huì )太在意。但是要獲得高質(zhì)量的檢測結果，增加實(shí)驗的可信度與重復性，一個(gè)進(jìn)階的實(shí)驗者必須考慮這些問(wèn)題了。