免疫沉淀（IP）的常見(jiàn)問(wèn)題及解答

1. 用于一般免染的抗體是否都可以用作免疫沉淀實(shí)驗？ 
答：抗體的性質(zhì)對免疫沉淀實(shí)驗影響很大?？贵w不同，和抗原以及Protein G或Protein A的結合能力也就不同。所以一般免染能結合的抗體未必能用于IP反應。 一般來(lái)說(shuō)，多抗是沉淀反應更好的選擇。另外，純化的單抗、腹水和雜交瘤上清液也可用于免疫沉淀。

2. 為什么溶解抗原的緩沖液中要加入一定量的蛋白酶抑制劑？ 
答：從活性細胞裂解出來(lái)的樣品中，往往含有一定量的蛋白酶。為防止預檢測蛋白的分解，修飾，溶解抗原的緩沖液必須加蛋白每抑制劑，并且在低溫下進(jìn)行實(shí)驗。

3. 溶解抗原的緩沖液的配制需要注意什么？ 
答：多數的抗原是細胞構成的蛋白，特別是骨架蛋白，緩沖液必須要使其溶解。為此，必須使用含有強表面活性劑的緩沖液，盡管它有可能影響一部分抗原抗體的結合。另一面，如用弱表面活性劑溶解細胞，就不能充分溶解細胞蛋白。即便溶解也產(chǎn)生與其它的蛋白結合的結果，抗原決定族被封閉，影響與抗體的結合。

4. 免疫沉淀實(shí)驗應如何把握抗體和緩沖液的比例？ 
答：每次沉淀實(shí)驗之前，考慮抗體/緩沖液的比例十分重要?？贵w過(guò)少就不能檢出抗原，過(guò)多則就不能沉降在beads上，殘存在上清；緩沖劑太少則不能溶解抗原，過(guò)多則抗原被稀釋。具體比例視具體情況而定。

5. 免疫沉淀應該如何配制細胞裂解液？ 
答：適當的細胞裂解液的選擇取決于所要研究蛋白的特性。TritonX-100,NP40是非離子界面活性劑，作用溫和;DOC(sodium de-oxycholate)，SDS是離子性的強活性劑。所以裂解液的配制時(shí)所用去污劑的種類(lèi)和濃度以及鹽濃度等條件需實(shí)驗者進(jìn)行優(yōu)化。注意如果忘記加TritonX-100，只加DOC或SDS，可能使抗體完全失去活性。