WB實(shí)驗步驟

1、蛋白樣品的制備：通過(guò)有機溶劑或水溶法制備總蛋白

2、做膠：檢測抗原10－30kd, 用15％分離膠；30－100kd, 用10％分離膠；100－200kd，用7.5％分離膠。

3、跑膠：壓縮膠電壓：80V（10mA）；分離膠電壓：120V（20mA）當溴酚蘭指示劑到達凝膠底部時(shí)，即停止電泳。

4、轉膜：目的蛋白分子80-140kDa時(shí)，膠濃度8%，轉移時(shí)間為1.5-2小時(shí)；目的蛋白分子25-80kDa時(shí)，膠濃度10%，轉移時(shí)間為1.5小時(shí)；目的蛋白分子15-40kDa時(shí)，膠濃度12%，轉移時(shí)間為0.75小時(shí)；目的蛋白分子＜20kDa時(shí)，膠濃度15%，轉移時(shí)間為0.5小時(shí)；

5、封閉：脫脂奶粉（5％）、BSA、Western Blot 膜封閉液

6、一抗雜交：5％奶粉或2％BSA稀釋抗體（稱(chēng)一抗），稀釋比例按抗體說(shuō)明,室溫孵育1hr，TBST 洗5 mins 3-5 次。

7、二抗雜交：將膜跟5％奶粉或2％BSA稀釋的2 抗一起孵育，室溫1hr。TBST 洗5 mins 3-5 次。

8、底物顯色：