Western blot 實(shí)驗技術(shù)及常見(jiàn)問(wèn)題分析

Western blot基本原理：

在電場(chǎng)的作用下將電泳分離的多肽從SDS-PAGE凝膠轉移至一種固相支持體，然后用這種多肽的特異抗體來(lái)檢測。

Western blot應用：

目的蛋白的表達特性分析；

目的蛋白與其他蛋白的互作；

目的蛋白的組織定位；

目的蛋白的表達量分析；

Western blot一般流程：

蛋白樣品的制備：

1 水溶液提取法：稀鹽和緩沖系統的水溶液對蛋白質(zhì)穩定性好、溶解  度大，是提取蛋白質(zhì)常用的的溶劑，操作相對麻煩，重復性一般；

2 有機溶劑提取法；

3 離心管柱提取法：超快速，易用，高產(chǎn)及重復性強；

4 通過(guò)層析或電洗脫法制備目的蛋白。

Western blot注意事項和常見(jiàn)問(wèn)題：

1 我的細胞提取液有的有沉淀，有的很清亮，為什么呢？

答：有沉淀可能因為你的蛋白沒(méi)有變性完全，可以適當提高SDS 濃度，同時(shí)將樣品煮沸時(shí)間延長(cháng)； 也不排除你的抗原濃度過(guò)高，這時(shí)再加入適量上樣緩沖液即可。

2 我做的蛋白質(zhì)分子量很?。?0 KD），請問(wèn)怎么做WB？

答：可以選擇0.2 μm的膜，同時(shí)縮短轉移時(shí)間。也可以將兩張膜疊在一起，再轉移。

3 最后顯色時(shí)用 DAB好還是ECM好？

答：DAB 有毒，但是比較靈敏，是HRP 敏感的底物；ECM結果容易控制，但被催化時(shí)靈敏度差一點(diǎn)，但如果達到閥值，就特別靈敏，可以檢測pg 級蛋白，具體可以根據你實(shí)驗的情況。

4 要驗證某個(gè)細胞上有無(wú)該蛋白的存在，需要做免疫組化和western blot試驗嗎？做這兩個(gè)試驗時(shí)的一抗和二抗可以共用嗎？

答：①免疫組化可以用來(lái)進(jìn)行定位，但是不能精確定量，而且有時(shí)會(huì )有假陽(yáng)性，不易與背景區分；Western  blot可以特異性檢測某個(gè)蛋白質(zhì)分子，進(jìn)行定 量，但是不能定位。

   ②兩種實(shí)驗的一抗有時(shí)候不能通用，公司的產(chǎn)品說(shuō)明一般都會(huì )說(shuō)明可以進(jìn)行什么實(shí)驗，在免疫組化時(shí)，是否適合石蠟切片或者冰凍切片。

5 細胞水平要做western blot，多少細胞提的蛋白夠做western blot？

答：一般5×10⁶就足夠了。

6 同一樣品能同時(shí)提RNA又提蛋白么？這樣對western blot有無(wú)影響？

答：能，沒(méi)有問(wèn)題。

7 同一蛋白樣品能同時(shí)進(jìn)行兩種因子的Western Blot檢測嗎？

答：當然可以，有的甚至可以同時(shí)測幾十種樣品。

8 蛋白變性后可以存放多久？

答：－80℃，一兩年沒(méi)有問(wèn)題。關(guān)鍵兩條：不要被蛋白酶水解掉；不要被細菌消化掉（也是被酶水解了）。

9 二抗是生物素化的抗體，三抗是親和素生物素體系，不知采用這樣的方案后，封閉液是否要作調整，能否再用5％的脫脂奶粉呢？

答：不能使用脫脂奶粉，因為脫脂奶粉中含生物素，用ＢＳＡ代替應該好一點(diǎn)。

10 做組織樣品的western的時(shí)候，怎樣處理樣品？

答：必須進(jìn)行研磨、勻漿、超聲處理，蛋白質(zhì)溶解度會(huì )更好，離心要充分，膜蛋白需用更劇烈的方法抽提，低豐度膜蛋白可能還要分步抽提(超速離心)。還有一點(diǎn)就是組織中的蛋白酶活性更強，需要注意抑制蛋白酶的活性。

11 免疫組化和Western Blot可以用同一種抗體嗎？

答：免疫組化時(shí)抗體識別的是未經(jīng)變性處理的抗原決定簇（又稱(chēng)表位），有些表位是線(xiàn)性的，而有的屬于構象型；線(xiàn)性表位不受蛋白變性的影響，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；構象型表位由于受蛋白空間結構限制，煮后變性會(huì )消失。如果你所用的抗體識別的是蛋白上連續的幾個(gè)氨基酸，也就是線(xiàn)性表位，那么這種抗體可同時(shí)用于免疫組化和Western，而如果抗體識別構象形表位，則只能用于免疫組化。

12 在做Western Blot時(shí)，PVDF膜用甲醇浸泡的目的？

答：PVDF膜用甲醇泡的目的是為了活化PVDF膜上面的正電基團，使它更容易跟帶負電的蛋白質(zhì)結合，做小分子的蛋白轉移時(shí)多加甲醇也是這個(gè)目的。

13 檢測同一抗體的磷酸化和非磷酸化的抗原可以在同一張膜上嗎？

答：可以。

14 蛋白質(zhì)的分子量跨度很大，如要分離小21KD，中至66KD，大至170KD，可以一次做好嗎？

答：這么廣的分布不好轉移，一般建議：21kd和66kd可以一起轉，12％SDS-PAGE，濕轉120mA， 45-60min就可以了， 可以根據你實(shí)驗室的經(jīng)驗調節；170kd 用 7% SDS－PAGE，200mA 90-120min。

15 細胞裂解液選擇蛋白酶抑制劑時(shí)有什么原則嗎？受不受組織來(lái)源的影響？胞膜和胞漿有區別嗎？

答：一般來(lái)說(shuō)提取時(shí)加入廣譜的蛋白酶抑制劑就可以了，操作時(shí)保持低溫。若有特殊要求可以選擇相應的蛋白酶抑制劑。

16 PVDF膜和硝酸膜結合蛋白的原理是什么？

答：一般而言，硝酸纖維素膜是通過(guò)疏水作用來(lái)和蛋白質(zhì)相聯(lián)，這樣的話(huà)，反復洗幾次后，蛋白容易掉下來(lái)，結果較差。PVDF膜主要通過(guò)它膜上的正電荷和蛋白接合，同時(shí)也有疏水作用，但相對較弱。這樣的話(huà)，PVDF膜和蛋白接合較牢，不易脫落，結果較好。

17 westernblot內參選擇什么合適？

答：這與目標抗原的表達位置有關(guān)，對于胞漿和全細胞蛋白，可選擇內參β-actin、GAPDH和Tubulin；線(xiàn)粒體蛋白則可選擇內參VCDA1/Porin和COXIV；核內抗原可以選擇內參Lamin B1、TBP和histone。

18 不能很好地將大分子量蛋白轉移到膜上，轉移效率低？

答：轉移緩沖液中加入20% 甲醇（終濃度），因為甲醇可降低蛋白質(zhì)洗脫效率，但可增加蛋白質(zhì)和NC膜的結合能力，甲醇可以防止凝膠變形，甲醇對高分子量蛋白質(zhì)可延長(cháng)轉移時(shí)間；轉移緩沖液加入終濃度0.1%SDS，也能增加轉移效率；使用戊二醛交聯(lián)；降低凝膠濃度，如低至6-7%或提高轉膜電壓/電流，增加轉移時(shí)間。

19 轉膜時(shí)凝膠腫脹或卷曲？

答：可將凝膠在轉膜前放到轉膜緩沖液中浸泡5-10min。

20 跑膠的條帶歪斜或者漂移？

答：電轉儀長(cháng)期使用導致海綿變薄，“三明治”結構不緊湊導致，可更換或者在兩塊海綿之間墊上少許普通的草紙。

21 轉膜后膜上有單個(gè)或多個(gè)白點(diǎn)？

答：轉膜時(shí)確保膜和膠塊之間沒(méi)有氣泡。

22 轉膜緩沖液過(guò)熱？

答：緩沖液中離子濃度太低，電流或者電壓過(guò)高，轉膜過(guò)程中注意降溫。

23 顯影后膠片背景太高？

答：轉膜前PVDF膜沒(méi)有用100%甲醇完全浸濕；洗膜不充分，可以增加膜洗滌次數；封閉不完全，選擇合適的封閉液和提高封閉時(shí)間；二抗濃度過(guò)高，降低二抗濃度；一抗特異性不強，換用特異性較強的單克隆抗體；曝光時(shí)間過(guò)長(cháng)，減少曝光時(shí)間。

24 結果沒(méi)有條帶或者條帶很淺，雜交信號很弱？

答：樣品中不含靶蛋白或者含量太低，可增加蛋白上樣量，設置已知標準量蛋白的對照；抗體稀釋比例太低，孵育時(shí)間不夠；轉膜不好，轉膜后可先用麗春紅染色觀(guān)看染色效果；曝光時(shí)間過(guò)短，增加曝光時(shí)間；抗體保存不當，效價(jià)降低。

25 目的條帶位置偏低或者偏高？

答：膠濃度不適合，高分子量要用低濃度膠，小分子蛋白要用高濃度膠。

26 有非特異性條帶？

答：目的蛋白有多個(gè)修飾位點(diǎn)（磷酸化位點(diǎn)、糖基化位點(diǎn)、乙?；稽c(diǎn)等），本身可以呈現多條帶；一抗特異性不好，換用特異性較好的單克隆抗體；二抗非特異性引起的結果，可設立一組不加一抗只加二抗的平行對照來(lái)檢測二抗是否有非特異性結合；樣品蛋白質(zhì)可能降解，提取蛋白時(shí)注意冰上操作，加入適當的蛋白酶抑制劑，避免樣品反復凍融；抗體濃度過(guò)高，降低一抗和二抗的濃度。

27 膠片是一片空白，是怎么回事？

答：如果能夠排除下面的幾個(gè)問(wèn)題那么問(wèn)題多半出現在一抗和抗原制備上。     二抗的HRP 活性太強，將底物消耗光；ECM底物中H2O2，不穩定，失活；ECL底物沒(méi)覆蓋到相應位置；二抗失活。

28 目的條帶是白色，周?chē)斜尘埃?/u>