免疫沉淀技術(shù)

免疫沉淀原理：
免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）是利用抗原蛋白質(zhì)和抗體的特異性結合以及細菌蛋白質(zhì)如“proteinA”特異性地結合到免疫球蛋白的FC片段的現象而開(kāi)發(fā)出來(lái)的分離抗原的免疫學(xué)方法。目前多用的“proteinA”等預先結合固化在A(yíng)garosebeads上，使之與含有抗原的溶液幾抗體反應后，beads上的proteinA就能吸附抗原達到精制的目的。（如圖1）

二、免疫沉淀實(shí)驗方案（供實(shí)驗者參考）：
（一）實(shí)驗材料
試劑及緩沖液：①細胞裂解產(chǎn)物（樣品）；②ProteinGorProteinAslurry；③一抗；④細胞裂解緩沖液；⑤PBS；⑥SDS-PAGEsamplebuffer；⑦蛋白酶抑制劑
設備：①離心機；②搖床或rotator

（二）實(shí)驗方法：
A)樣品（細胞裂解物）準備
1.收集約107細胞。
（注：1ml體積中所含細胞總數和合適的凝膠上樣量取決于不同蛋白以及其抗體的特性）
2.加入約10ml的PBS到錐形管中，并用400×g離心10分鐘洗滌細胞。
3.棄去上清液并重復第2步洗滌細胞。
（注：對于細胞培養皿中的單層貼壁細胞，吸除細胞培養液后，用PBS洗滌兩次，盡量避免破壞細胞層）
4.完全棄去上清液后，加入1ml預冷的含蛋白酶抑制劑（ProteaseinhibitorCocktail）的細胞裂解液重懸細胞。小心地vortex混勻.
（注：為防止蛋白酶的作用，細胞裂解液應當預冷。所有接下來(lái)的操作都在低溫條件下進(jìn)行，并且蛋白酶抑制劑預先添加到細胞裂解液中;此步驟對于細胞培養皿中的單層貼壁細胞，可在10cm的培養皿中加入1ml預冷的含蛋白酶抑制劑的細胞裂解）。
5.把錐形管或培養皿放在冰上孵育30分鐘，并間斷性地混勻。
6.4℃，10000×g離心細胞裂解物15分鐘。
7.小心地收集上清液轉置干凈的管中備用；此樣品可凍存于-80℃作長(cháng)期保存。

B）樣品的預清洗(可選做)
1.在eppendorf管中加入50ulProteinGbeadslurry，并加入450ul預冷的細胞裂解液。10000×g離心30秒后棄去細胞裂解液;用500ul預冷的細胞裂解液重復洗滌一次，最后用50ul預冷的細胞裂解液重懸微球。
2.把洗滌好的50ulProteinGbead加入到盛有500ul細胞裂解樣品的eppendorf管中，于冰上孵育30-60分鐘。
3.4℃，10000×g離心10分鐘后把上清液轉移到新的eppendorf管。若轉移過(guò)來(lái)的上清液中仍含有ProteinGbead，可以再次離心處理后小心地轉移上清到另一新的eppendorf管。

C）免疫沉淀
1.在盛有預清洗的細胞裂解樣品的eppendorf管中加入5-10ug相應抗體。
（注：抗體的濃度是影響免疫沉淀反應的重要因素；建議實(shí)驗者進(jìn)行預實(shí)驗摸索出合適的使用濃度）
2.4℃孵育1小時(shí)。
3.加入50ul預洗的ProteinGbeadslurry（微珠處理參考上面樣品的預清洗中第一步方法）。
4.于4℃旋轉混勻孵育1小時(shí)。
5.4℃，10000×g離心eppendorf管30秒。
6.小心并盡量完全地移除上清液后用500ul的細胞裂解液洗滌微珠3-5次；為減少非特異背景影響，每次洗滌都要盡量小心并完全地移除上清液。
7.最后一次洗滌并棄去上清液后加入50ul的Laemmlisamplebuffer工作液。旋渦混勻后加熱至90-100℃十分鐘。
8.10000×g離心5分鐘，收集上清液。取部分或全部樣品用于SDS-PAGE電泳，暫時(shí)不用的樣品可以-20℃保存。
9.按照電泳說(shuō)明進(jìn)行SDS-PAGE電泳。染膠分析沉淀蛋白。
（注：如果接下來(lái)用于免疫印跡（WB）分析，則按相應的WB操作步驟繼續實(shí)驗。推薦用eBioscience的TrueBlotTM可以得到更佳WB的效果；WB的抗體使用濃度和免疫沉淀的濃度不同，需視具體情況而定，這里建議應用不同克隆號的抗體。）

三、附錄：
（1）緩沖液的制備參考
NP-40CellLysisBuffer:
50mMTris-HclpH8.0
150mMNacl
1%NP-40
ProteaseinhibitorCocktail:
PMSF,5mg(50ug/ml)
Aprotinin,100ug(1ug/ml)
Leupeptin,100ug(1ug/ml)
Pepstatin,100ug(1ug/ml)
100%Ethanolbringupto1ml,aliquot

（2）免疫沉淀（IP）的常見(jiàn)問(wèn)題及解答

1.用于一般免染的抗體是否都可以用作免疫沉淀實(shí)驗？
答：抗體的性質(zhì)對免疫沉淀實(shí)驗影響很大?？贵w不同，和抗原以及ProteinG或ProteinA的結合能力也就不同。所以一般免染能結合的抗體未必能用于IP反應。
一般來(lái)說(shuō)，多抗是沉淀反應更好的選擇。另外，純化的單抗、腹水和雜交瘤上清液也可用于免疫沉淀。

2.為什么溶解抗原的緩沖液中要加入一定量的蛋白酶抑制劑？
答：從活性細胞裂解出來(lái)的樣品中，往往含有一定量的蛋白酶。為防止預檢測蛋白的分解，修飾，溶解抗原的緩沖液必須加蛋白每抑制劑，并且在低溫下進(jìn)行實(shí)驗。

3.溶解抗原的緩沖液的配制需要注意什么？
答：多數的抗原是細胞構成的蛋白，特別是骨架蛋白，緩沖液必須要使其溶解。為此，必須使用含有強表面活性劑的緩沖液，盡管它有可能影響一部分抗原抗體的結合。另一面，如用弱表面活性劑溶解細胞，就不能充分溶解細胞蛋白。即便溶解也產(chǎn)生與其它的蛋白結合的結果，抗原決定族被封閉，影響與抗體的結合。

4.免疫沉淀實(shí)驗應如何把握抗體和緩沖液的比例？
答：每次沉淀實(shí)驗之前，考慮抗體/緩沖液的比例十分重要?？贵w過(guò)少就不能檢出抗原，過(guò)多則就不能沉降在beads上，殘存在上清；緩沖劑太少則不能溶解抗原，過(guò)多則抗原被稀釋。具體比例視具體情況而定。

5.免疫沉淀應該如何配制細胞裂解液？
答：適當的細胞裂解液的選擇取決于所要研究蛋白的特性。TritonX-100,NP40是非離子界面活性劑，作用溫和;DOC(sodiumde-oxycholate)，SDS是離子性的強活性劑。所以裂解液的配制時(shí)所用去污劑的種類(lèi)和濃度以及鹽濃度等條件需實(shí)驗者進(jìn)行優(yōu)化。注意如果忘記加TritonX-100，只加DOC或SDS，可能使抗體完全失去活性。