拿什么拯救您的細胞穩轉實(shí)驗？是時(shí)候展現真正的技術(shù)了

一般來(lái)說(shuō)，外源基因導入動(dòng)物細胞可分為瞬時(shí)轉染和穩定轉染。瞬時(shí)轉染導入的DNA僅能在動(dòng)物細胞中維持數天，穩定轉染導入的DNA能整合進(jìn)動(dòng)物細胞基因組中，隨后細胞經(jīng)過(guò)分裂增殖形成穩定表達轉染基因的細胞系。在轉染的基因表達質(zhì)粒（或共轉質(zhì)粒）上添加選擇標記，是篩選穩定轉染細胞的最常用方法之一。

想要做好穩轉，掌握下列幾項妥妥的沒(méi)問(wèn)題~

選擇穩轉質(zhì)粒

需要含有選擇標記（例如抗生素抗性基因）的基因表達質(zhì)粒，選擇標記可以位于基因表達質(zhì)粒上，或者位于共轉染的單獨的質(zhì)粒上。陰性對照應使用不含選擇標記的基因表達質(zhì)粒轉染細胞。 

穩轉之前 

• 確保使用的細胞系可以從分離的細胞中產(chǎn)生克隆，因為一些細胞需要互相接觸才能生長(cháng)；

• 選擇合適的篩選標記；

• 選擇適合您細胞類(lèi)型的轉染方法；

• 通過(guò)建立劑量-反應曲線(xiàn)（殺傷曲線(xiàn)）確定細胞類(lèi)型的篩選條件（Ausubel等，1995）。

殺傷曲線(xiàn)建立

最適濃度通過(guò)建立細胞殺傷曲線(xiàn)來(lái)確定。每種真核細胞系對不同抗生素的敏感度不同(某些細胞系能夠完全抵抗某種抗當素)，針對每種用于穩定轉染的新細胞系或細胞株，殺死未轉染細胞所需的最適濃度必須通過(guò)實(shí)驗來(lái)確定。

(*應為每種細胞類(lèi)型建立殺傷曲線(xiàn)，并且每次使用新批次的選擇性抗生素)

遺傳霉素（Geneticin, G418）是一種氨基糖甙抗生素，是穩定轉染常用的篩選抗生素之一。哺乳動(dòng)物細胞的篩選濃度根據細胞類(lèi)型等多種因素而變化，以InvivoGen的G418為例（不同廠(chǎng)家不同批次產(chǎn)品溶解度各有差異，僅供參考）。在開(kāi)始實(shí)驗前，建議通過(guò)測試幾種濃度（100 μg/ ml至1 mg / ml）來(lái)確定殺死宿主細胞系所需的最佳抗生素濃度。

InvivoGen建議的工作濃度：G418通常以400 μg/ ml的濃度使用。當然仍需要為您的細胞確定最佳濃度。下面列出了常見(jiàn)哺乳動(dòng)物細胞使用G418篩選的濃度（參見(jiàn)下表）。

好不容易get到了實(shí)驗技巧，奈何無(wú)機會(huì )試手？

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試用裝規格：1ml G418溶液 (濃度：100mg/ml)

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活動(dòng)時(shí)間：即日起，發(fā)完即止（數量有限~）

InvivoGen G418產(chǎn)品特點(diǎn)

產(chǎn)品濃度：100 mg/ml （in HEPES buffer）

CAS number：108321-42-2

質(zhì)控：每批產(chǎn)品都經(jīng)過(guò)全面測試，以確保不存在批次差異

純度：≥90％（HPLC）

內毒素水平：<0.5 EU / mg

細胞測試：在G418敏感和G418抗性哺乳動(dòng)物細胞系中驗證產(chǎn)品效果

產(chǎn)品信息

InvivoGen 1977年成立于法國，是法國最早的生物科技公司。公司成立的初期階段主要提供細胞培養相關(guān)試劑，如抗支原體、細菌、真菌污染的抗生素以及基因篩選抗生素（Blasticidin, Puromycin, Hygromycin B, G418, Zeocin）。隨著(zhù)天然免疫研究熱點(diǎn)的興起，InvivoGen于2000年開(kāi)始致力于天然免疫相關(guān)產(chǎn)品的研發(fā)和生產(chǎn)，并成為全世界最優(yōu)質(zhì)、最專(zhuān)業(yè)的天然免疫相關(guān)產(chǎn)品生產(chǎn)商。InvivoGen為天然免疫研究提供一整套研究方案，包括不斷更新的模式識別受體（PRRs）激動(dòng)劑和拮抗劑，PRRs報告基因細胞以及天然免疫信號通路的誘導劑和抑制劑等。