簡(jiǎn)單快速獲得多形核粒細胞(PMNs)的方法

多形核粒細胞(PMNs)，主要是中性粒細胞，同時(shí)包括少量嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞。

PMNs是血液循環(huán)中最豐富的白細胞，是對組織損傷和感染的第一反應細胞。在絕大多數情況下，面對病菌入侵PMN都能做出適當的反應，以保持體內平衡和機體健康。PMNs的浮力密度往往比單核細胞大得多（>1.085 g/ml），但是在利用分離液分離的過(guò)程中會(huì )遇到一個(gè)問(wèn)題，就是紅細胞的浮力密度往往在1.09 - 1.11 g/ml之間，這使得使用密度分離液從全血中分離PMNs變的很困難。

Serumwerk Bernburg AG 生產(chǎn)的Polymorphprep分離液的高滲透壓可使紅細胞失水而縮小，從而增大紅細胞的有效浮力密度，同時(shí)分離液中的葡蔗糖能促使紅細胞聚集并在溶液中快速沉降，隨著(zhù)離心過(guò)程紅細胞會(huì )被逐漸沉降到底部，所以利用Polymorphprep分離液可以快速有效的獲得PMNs。

紅細胞在Polymorphprep中分離的過(guò)程

多形核粒細胞分離操作步驟：

1、血液樣本的制備。

為了達到最好的效果，使用抗凝全血，如EDTA，肝素或檸檬酸。EDTA 抗凝效果最佳。

2、將5毫升血液+ 5毫升分離液放入15毫升試管中，下層是分離液上層是血液。

3、500-550g離心30分鐘，溫度在18°C-22°C（允許轉子在沒(méi)有剎車(chē)的情況下減速）

4、離心后，可以看到兩圈白膜層。上面PBMCs,下層是PMNs, 小心吸取PMN。

為使PMNs恢復正常滲透壓，應加入1體積的0.45% NaCl溶液或0.5體積正常濃度的培養基進(jìn)行稀釋。如需進(jìn)一步稀釋?zhuān)墒褂蒙睇}水或培養基。

5 、將細胞懸浮液轉移到一個(gè)15ml的試管中，加入2ml PBS, 400 g離心10分鐘(18-22°C)，也可以被重懸在培養基中完成后續實(shí)驗。

注意事項：

1、該分離液僅適用于人的未作稀釋的血液，不適用于動(dòng)物血液。

2、建議使用兩小時(shí)內的新鮮血液，待分離血液和待用分離液的溫度需要保持在18度-22度之間。

3、注意離心時(shí)間越長(cháng)或離心力越大，會(huì )導致PMN進(jìn)一步向紅細胞處遷移。

4、這里使用15ml離心管，推薦用5 ml血液+ 5 ml分離液進(jìn)行密度梯度離心，若使用50ml離心管，建議使用 18 ml 血液+18 ml Polymorphprep?。

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參考文獻：

1.https://diagnostic.serumwerk.com/products/polymorphprep/

2.Noah Fine ¹, Nikola Tasevski ¹ The Neutrophil: Constant Defender and First Responder Front Immunol  2020 Sep 24;11:571085.  doi: 10.3389/fimmu.2020.571085.