血球計數板計數誤差的來(lái)源及解決方案 ——自動(dòng)化計數

引言

血球計數板一直是實(shí)驗室細胞計數的金牌標準。自從18世紀在法國第一次被用于分析病人的血液樣本，血球計數板在過(guò)去幾百年中已經(jīng)得到一系列的重大發(fā)展，相比以前計數更為精確、使用更為簡(jiǎn)單，并最終形成了今天我們使用的樣子?，F在血球計數板計數仍然是所有細胞學(xué)研究的一個(gè)組成部分，然而其計數存在的問(wèn)題由于自身固有的設計和使用方法并沒(méi)有隨著(zhù)時(shí)間而消失。我們在這里將要列出造成血球計數板計數誤差的來(lái)源， 并將討論自動(dòng)化計數是如何消除這些問(wèn)題的。

血球計數板計數誤差的來(lái)源

1. 人工失誤(混勻、加樣、稀釋、計算錯誤以及人工操作誤差)

a. 在對5個(gè)操作者的觀(guān)察中，操作錯誤和隨機錯誤分別占3.12%和7.8%[3]。

b. James M. Ramsey做了一項實(shí)驗，衡量取樣區和稀釋系數如何影響計數的準確性。

他測試了3個(gè)取樣區面積(18, 9和4 mm2)及兩個(gè)稀釋系數(1:100 和 1:25)。取樣面積減小時(shí)CVs值是升高的，稀釋倍數的升高會(huì )降低CVs[4]。

 c. Bane 發(fā)現，當同一個(gè)操作者去對同樣的兩份精液樣品計數時(shí)，計數結果的差異55%歸因于取樣和移液?jiǎn)?wèn)題， 45%歸因于計數室和細胞計數問(wèn)題 [5]。 Freund和Carol 展開(kāi)的另外一項實(shí)驗表明，不同操作者之間的計數差異能高達52%，而同一個(gè)操作者的計數差異為20%[5]。

2. 多次計數以保證結果準確性的必要性

a. 1907年， John C. DaCosta 聲明，為了得到精確的計數結果，很有必要取血液樣品中的多滴血液分別進(jìn)行計數[1]。

b. Nielsen, Smyth和Greenfield得出結論， 為了得到10%, 15%和 20%的血球計數板計數準確性, ，必需的樣品數分別為7份, 3份和2份,每份樣品中分別包含180個(gè), 200個(gè)和125個(gè)細胞[6]。

c. 1881年， Lyon 和Thoma推測血球計數板的標準誤差為 ,其中n即計數的細胞數目。

d. 1907年, William Sealy以“學(xué)生”的名義發(fā)布了他計數釀啤酒師的酵母的工作，他特地通過(guò)實(shí)驗和數學(xué)模型計算了計數誤差，公式也為[7,8]。

3. 細胞均勻分布的要求

a. 1912年， James C. Todd將細胞分布不均勻列為計數誤差的問(wèn)題來(lái)源[1]。

b. 學(xué)生也說(shuō)有兩項主要的計數誤差來(lái)源，一為吸取的酵母樣品不能夠代表原液的濃度，另一個(gè)是隨機取樣時(shí)細胞在計數區域分布不均勻[7,8]。

c. 1947年, 一篇文章提到血球計數板中的細胞濃度分布不均勻問(wèn)題。初布的結果顯示，離進(jìn)樣口的濃度分別比平均濃度低3.5%和高3.5%[9]。

4. 儀器及材料差異(柵格，深度，蓋玻片，緩沖液類(lèi)型以及移液器) 

a. 結果顯示計數室的計數誤差和移液器（CV%）造成的計數誤差分別在大約4.6% 和4.7%[10]。

b. 在一項5個(gè)計數人員的計數實(shí)驗中，移液器和血細胞計數器造成的誤差分別為9.46% 和4.26%[3]。

c. 1961年, Sanders和Skerry得出結論，蓋玻片的位置能造成7.6%的計數差異[11]。 

d. 在關(guān)于不同稀釋步驟的計數實(shí)驗中，隨著(zhù)稀釋步驟的增加，變異系數升高，每個(gè)血細胞計數系統的誤差如下： Bürker-Türk (BT) (7.7%-12%), Thoma (6.6%-14.1%), Makler (19.8%-23.6%)[12]。

解決血球計數板的計數問(wèn)題

隨著(zhù)新技術(shù)的發(fā)展，如計算機技術(shù)、自動(dòng)化軟件、光學(xué)鏡片、熒光染料、精密制造，以及現代技術(shù)如熒光顯微技術(shù)、流式細胞術(shù)、圖像細胞術(shù)，自動(dòng)化已經(jīng)解決了血球計數板存在的許多問(wèn)題[13-25]。

自動(dòng)化計數解決：

人工操作誤差 - 為了解決這個(gè)問(wèn)題，自動(dòng)化和機器人技術(shù)能夠代替人工的樣品操作和計數操作。

加樣誤差 - 取樣區越多、計數細胞越多，隨機誤差越小，但是需要時(shí)間越多。通過(guò)應用自動(dòng)取樣或者成像技術(shù)，成千上百萬(wàn)的細胞能在很短時(shí)間內被分析，提高了效率，并把分析中的隨機誤差降到更低。 

移液和稀釋誤差 - 這些取決于操作者的操作經(jīng)驗。通過(guò)采用自動(dòng)加樣器或者自動(dòng)液流系統，這個(gè)誤差可以被降到更低[26]。

材料誤差 - 計數室的誤差是由于不同品牌的血球計數板或者同一品牌不同批次間的差異造成的。這也可以通過(guò)自動(dòng)細胞計數儀（細胞計數儀的選擇，請查閱 http://dakewe.com/product/view/id-71.html 或百度文庫 http://wenku.baidu.com/view/f13faf4916fc700abb68fc54.html  中《細胞計數儀的選擇》一文）增加取樣量及減小隨機誤差來(lái)解決。

細胞分布不均勻 – 血球計數板不合適的清洗，或者蓋玻片放置不正確將會(huì )產(chǎn)生誤差。這些可以通過(guò)不使用計數室的細胞計數儀來(lái)消除，比如流式細胞儀。但是細胞樣品中若是存在細胞團，基于液流計數的儀器將很難計數，而使用圖像計數儀，細胞團可以使用圖像分析算法計數聚集的細胞，這樣可以提高細胞計數的準確性。

綜述

血球計數板幾百年來(lái)在生物醫學(xué)研究中一直都是一個(gè)必備的工具，并且經(jīng)歷了很多的改進(jìn)形成了今天研究者們使用的樣子，然而它仍然會(huì )造成很多不可避免的計數誤差。今天，現代化的自動(dòng)細胞計數儀的使用已經(jīng)很大程度上消除了許多出現誤差的來(lái)源，提高了細胞計數的準確性和效率。

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