在常規的ELISpot實(shí)驗中，每個(gè)實(shí)驗孔只能檢測一種細胞因子。借助FluoroSpot就可以實(shí)現在一個(gè)孔內同時(shí)檢測兩種或兩種以上的細胞因子或抗體。FluoroSpot擁有ELISpot的靈敏度，并且能夠同時(shí)分析幾種分泌物。這種高度靈敏的細胞分析方法相對穩定，易于操作。并且適合于單個(gè)檢測和大規模篩選實(shí)驗。熒光系統能同時(shí)檢測多種分析物，Mabtech以此為依據研發(fā)出了高品質(zhì)的雙色和三色熒光FluoroSpot試劑盒。

• 優(yōu)勢一：FluoroSpot具有靈敏度高，操作簡(jiǎn)便，應用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。

• 優(yōu)勢二：FluoroSpot能夠生成更多的數據，節省時(shí)間。與免疫斑點(diǎn)相比，使用的細胞和抗原均較少。

FluoroSpot 原理

FluoroSpot能夠分析抗原特異性的多功能T細胞，例如，IFN-γ和IL-2的分析。三明治夾心結構在熒光斑點(diǎn)中得以應用，不同特異性的單克隆捕獲抗體混合物被包被于96孔板的PVDF膜上，生物素標記的檢測抗體識別一種分泌物，tag標記的檢測抗體識別其它的分泌物來(lái)實(shí)現雙色或三色細胞因子分泌細胞的檢測。檢測通過(guò)帶有特定熒光基團的共軛試劑放大信號斑點(diǎn)，可用自動(dòng)讀板器進(jìn)行分析。

△雙色FluoroSpot原理圖

△三色FluoroSpot分析 能夠更容易的區分T細胞中不同的細胞因子

三色 FluoroSpot分析總共可以顯示7個(gè)亞群：3個(gè)單染的細胞因子，3個(gè)雙染的細胞因子，1個(gè)三色的細胞群。圖像顯示的是一個(gè)三色FluoroSpot分析結果。用一組病毒肽（CEF）刺激人的外周血單個(gè)核細胞（PBMC），分別用FITC標記IFN-γ、CY3標記IL-2和CY5標記TNF-α。Overylay展示的是三個(gè)指標疊后得到的結果。

用途

FluoroSpot用途廣泛，并且同樣適用于單個(gè)檢測和大規模篩選。三明治夾心法結合熒光基團標記的檢測試劑能夠對同一個(gè)孔中兩個(gè)或兩個(gè)以上的分析物進(jìn)行分析。

（一）T-cellFluoroSpot--抗原特異性T細胞檢測的理想方法

通過(guò)分泌單，雙和三色細胞因子分析劃分功能性T細胞亞群在許多不同的研究領(lǐng)域均引起極大的興趣。FluoroSpot可用于疫苗開(kāi)發(fā)，主要用于檢測和分析疫苗特異性免疫應答。在癌癥研究中，FluoroSpot可用于，例如監測腫瘤浸潤淋巴細胞或通過(guò)同時(shí)分析IFN-γ和顆粒酶B的分泌，以提供細胞毒性T細胞反應更直接的評估。Mabtech公司提供了各種不同的熒光斑點(diǎn)試劑盒用于單，雙和三色分析物的T細胞的分析，其中IFN-γ可單獨分析或與幾個(gè)不同的分析物同時(shí)進(jìn)行分析。

△HumanIFN-γ/IL-2雙色FluoroSpot

圖為細胞受PPD（純化蛋白衍生物）刺激分泌IFN-γ和/或IL-2的雙色熒光斑點(diǎn)分析。結果顯示在166個(gè)分泌IFN-γ的T細胞中，有114個(gè)細胞也能分泌IL-2。FITC(IFN-γ)和Cy3(IL-2)的圖像疊加后的斑點(diǎn)代表該細胞同時(shí)分泌這兩種細胞因子。

（二）B-cellFluoroSpot--確定分泌抗原特異性抗體細胞的總數

FluoroSpot可實(shí)現分析同一個(gè)孔中不同免疫球蛋白或亞型的表達情況。其主要應用的領(lǐng)域包括各種疾病和由免疫接種引起的B細胞免疫應答反應。例如，IgG、IgA和IgM的抗原特異性分泌物，可在接種疫苗前后進(jìn)行檢測。Mabtech公司提供雙色FluoroSpot試劑盒用于檢測人的IgG/IgA和IgG/IgM，以及三色FluoroSpot的試劑盒同時(shí)檢測 IgG/IgA/IgM。

（三）其他類(lèi)型的細胞

FluoroSpot還能夠用于樹(shù)突狀細胞、單核細胞和巨噬細胞的研究中，該檢測可以根據細胞因子不同的分布描繪不同的亞群。

注：數據分析FluoroSpot要使用配備有測定不同熒光基團的特定濾光片的自動(dòng)讀板機。

☆Mabtech公司研發(fā)了能夠用于人、小鼠和非人靈長(cháng)類(lèi)來(lái)源樣本的FluoroSpot試劑盒

具體產(chǎn)品如下：