哺乳動(dòng)物細胞表達系統中，關(guān)于蛋白純化的難點(diǎn)和解決方案，了解一下！

先前小達君給大家介紹了Strep-tag? 的歷史（點(diǎn)此回顧您想了解的Strep-tag：Strep-Tactin?XT發(fā)展史都在這里！），現在再隆重介紹 Strep-tag? 在哺乳類(lèi)細胞表達系統的應用。另外，小達君保證您看完后會(huì )心動(dòng)，然后回來(lái)參加活動(dòng)（點(diǎn)此參加分享IBA蛋白純化體驗，獲贈蛋白純化填料哦！），獲贈蛋白純化填料哦！

雖然大腸桿菌E.coli表達系統經(jīng)濟實(shí)惠，但由于缺乏重要的脂類(lèi)，分子螫合物，以及重要的翻譯后修飾，用它表達真核蛋白，可能會(huì )影響蛋白本身的折疊及功能，以膜蛋白為例，大腸桿菌表達系統能影響目標蛋白在細胞膜的插入位置及其應有的功能^[1]。除此之外，當目標蛋白大于50kDa時(shí)，使用大腸桿菌系統可能表達出不完整的蛋白^[2]。

所以，為了研究特定蛋白的功能（如：信號通路），生產(chǎn)較大型的蛋白，或進(jìn)行高解析度的結構分析，愈來(lái)愈多的實(shí)驗室選擇哺乳類(lèi)表達系統來(lái)生產(chǎn)融合蛋白。其原因為哺乳動(dòng)物細胞生產(chǎn)出的重組蛋白與人類(lèi)蛋白十分相似，有較完整的蛋白折疊、組合及翻譯后修飾^[3]。因此，愈來(lái)愈多科學(xué)家們更加關(guān)注于—如何從哺乳類(lèi)細胞中高效的純化目標蛋白。

首先，需考慮選擇合適的親和標簽。常用于哺乳動(dòng)物表達系統的親和標簽有His-tag、FLAG-tag、GST-tag及Strep-tag?等^[4-12]，整理于下表：

使用His-tag時(shí)，常遇到的問(wèn)題是寄主蛋白與填料的非特異性結合，在哺乳動(dòng)物重組蛋白的純化過(guò)程中，這樣的情況更為明顯。由于系統中有很多含有組氨酸（histidine）的殘基的蛋白，這種蛋白結構與his-tag相似，容易與鎳柱結合，因此導致目標蛋白純度降低^[13]。

FLAG-tag系統可在非變性條件下進(jìn)行純化，能得到高純度、有活性的蛋白，但其缺點(diǎn)為純化介質(zhì)較為不穩定，且純化成本高上許多^[5]。

另一常用的標簽為GST-tag，一個(gè)26kDa的蛋白，其特點(diǎn)是表達量高，具高度抗原性，常用來(lái)增加目標蛋白的溶解度，但常常會(huì )影響目標蛋白的特性，一般推薦純化后將標簽去除^[8]。

而Strep-tag?（包含Strep-tag?II或是Twin-Strep-tag?），都是短肽標簽，分別為8或28個(gè)氨基酸，一般不干擾蛋白折疊或活性，因此適合用于蛋白功能性研究^[5]。Strep-tag?可以特異性地結合在Strep-Tactin?(二代介質(zhì))或Strep-Tactin?XT(三代介質(zhì))的生物素的結合位點(diǎn)。洗脫時(shí)使用的脫硫生物素（適用于二代）或生物素（三代），對同樣的結合位點(diǎn)有更高的親和力，能將目標蛋白從同樣位置移除，因此得到的目標蛋白純度一般高于95%^[12]。

同時(shí)，三代的 Strep-Tactin?XT與Strep-tag?蛋白的親和力大幅提升，直接加入含目標蛋白的哺乳細胞的培養上清，即可高效純化出所需蛋白（注：原本使用二代需先以Avidin或是BioLock將培養基中的生物素遮蔽，才不會(huì )影響純化表現）。

圖A比較了His-tag與Strep-tag?直接加入哺乳細胞培養上清純化目標蛋白的表現。

此外，我們也測試了其他的蛋白，例如SEAP（72 kDa）或抗體（mAb，其重鏈為55kDa）。圖B為以Strep-Tactin?XT純化SEAP-TST、mCherry-TST與mAb-TST的SDS-PAGE分析結果，可見(jiàn)對于不同蛋白，Strep-tag?系統都能純化出高純度的目標蛋白。(注:紅色標記處為 mCherry的降解產(chǎn)物，非雜帶)

因Strep-Tactin?XT與Twin-Strep-tag蛋白的高親和力，即使目標蛋白的濃度低，使用Strep-Tactin?XT仍可以有效的捕捉上清中的目標蛋白。表C整理了幾個(gè)實(shí)驗的數據，顯示當目標蛋白濃度低于20μg/ml時(shí)，得率仍能達到幾近100%。

除了上述實(shí)驗所用的CHO細胞株外（中國倉鼠卵巢細胞），另一常用于生產(chǎn)蛋白的哺乳動(dòng)物細胞株為HEK293(人胚胎腎細胞)，使用上較CHO簡(jiǎn)單。我們測試了Strep-Tactin?XT的純化表現：表D1為以Expi293表達SEAP-TST或mAb-TST蛋白后，目標蛋白的濃度。圖D2為純化表現的SDS-PAGE分析。從中可知，與ExpiCHO培養基相同，直接將表達好的Expi293上清加入1ml Strep-Tactin?XT高載量重力柱中進(jìn)行純化，一樣能夠快速的得到高純度的目標蛋白。

綜上所述，Strep-tag?非常適合用在哺乳動(dòng)物細胞系中表達目標蛋白，其純化過(guò)程也與常見(jiàn)的ExpiCHO及Expi293培養基相容，不須另外處理，讓實(shí)驗流程更為便利。加上Strep-tag?系統在純度上的優(yōu)勢，是目前在這個(gè)應用上的絕佳選擇。

參考文獻

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[9] GE Healthcare (2016). Affinity Chromatography Handbook, Vol. 2: Tagged Proteins.

[10] Thermo Fisher Scientific (2015). Protein Expression Handbook

[11] Dynamic Biosensors (2018) Application Note: High-affinity capturing of tagged proteins on the switchSENSE? biochip using Strep-Tactin?XT.

[12] IBA Lifesciences (2016) Application Note: Strep-Tactin?XT:Twin-Strep-tag?- Advantages compared to the His-tag purification system.

[13] Bornhorst JA, Falke JJ (2000). Purification of proteins using polyhistidine affinity tags. Methods Enzymol., 326:245-54.

IBA lifesciences（德國）：IBA公司總部位于德國。二十年來(lái)，IBA以杰出的專(zhuān)利技術(shù)Strep-tag?系統為基礎，發(fā)展出完整的產(chǎn)品組合，涵蓋重組蛋白表達純化與固定以及特定細胞從全血或相關(guān)體液中分離的技術(shù)。同時(shí)，IBA也是全球領(lǐng)先的核酸合成專(zhuān)家，在DNA及RNA寡核苷酸的合成上已有超過(guò)二十年的經(jīng)驗，能根據客戶(hù)的選擇，生產(chǎn)含有特定染料或化學(xué)修飾的特殊寡核苷酸。