ELISPOT Part 4---- ELISPOT關(guān)于細胞處理相關(guān)問(wèn)題介紹

一、細胞處理

接下來(lái)，我們會(huì )從細胞的來(lái)源，如何培養，以及使用的培養基等幾個(gè)方面詳細的給大家介紹一下細胞樣本是如何處理的。

1. ELISpot 和 FluoroSpot適用于多種細胞類(lèi)型

細胞可以來(lái)源于各種來(lái)源以及不同的物種。比如培養的細胞系、人的全血或小鼠的脾臟。來(lái)自于粘膜組織的細胞也能應用于ELISpot。同時(shí)來(lái)源于不同物種的靜脈血和脾臟細胞也可用于ELISpot，例如猴子、小鼠、大鼠、牛、馬、羊、豬等。

2. 較常用的細胞--外周血單個(gè)核細胞（PBMC）

我們可以很容易地通過(guò)密度梯度離心法從血液中獲得外周血單個(gè)核細胞（Peripheral blood mononuclear cells, PBMC）。提取出來(lái)的PBMC可以直接使用，也可以被凍存，用于以后的ELISpot/FluoroSpot實(shí)驗。對于人來(lái)源的PBMC樣本，血液樣本中應該加入檸檬酸鈉抗凝或者直接使用肝素抗凝管收集。

3. 細胞的質(zhì)量是影響實(shí)驗結果至關(guān)重要的因素

在活細胞中，細胞凋亡的比例都不高，能夠正常的分泌蛋白質(zhì)，不會(huì )對實(shí)驗結果產(chǎn)生影響。細胞處理過(guò)程的標準化對于成功的細胞檢測是至關(guān)重要的，特別是對于ELISPOT/FLUOROSPOT實(shí)驗。從血液樣本中提取出來(lái)的PBMC，超過(guò)3小時(shí)就可能被活化的粒細胞污染，進(jìn)而影響實(shí)驗結果。

解決這一問(wèn)題的三種方法：

①在保存過(guò)程中輕輕攪拌血液樣品；

②在保存樣本前，用PBS或RPMI1:1稀釋血液樣本；

③在檢測前去除血液樣本中的粒細胞。

4. 實(shí)驗中可以使用凍存的細胞

在 ELISPOT 檢測的應用中，往往需要用到凍存的淋巴細胞樣品作為檢測細胞。由于 ELISPOT檢測的是細胞的免疫功能，不僅僅需要保持細胞的存活率，而且還要保證細胞的功能不發(fā)生變化。傳統的細胞凍存方法通常是為了保存細胞株，對細胞存活率的要求不高，更沒(méi)考慮保持細胞原有的免疫狀態(tài)，所以傳統的細胞凍存方法已經(jīng)不能滿(mǎn)足 ELISPOT 檢測的要求。

5. 細胞復蘇

細胞凍存和復蘇都會(huì )導致不同數量的細胞死亡，這在我們復蘇后并不能馬上觀(guān)察到。我們建議復蘇后的細胞在37°C新鮮的培養基中放置1小時(shí)或更長(cháng)時(shí)間。 這樣細胞碎片就可以很容易地被去除，并提高了檢測性能。

二、ELISpot和FluoroSpot的血清和培養基

細胞培養環(huán)境能夠影響我們的實(shí)驗結果，其中培養基起著(zhù)至關(guān)重要的作用。請考慮以下方面，以產(chǎn)生高效的細胞培養物。

1. 培養基

用于ELISpot和FluoroSpot的細胞培養基應與待測細胞相容。 RPMI培養基常與血清一起使用。如果在細胞培養過(guò)程中CO2受到限制，可以加入HEPES以維持細胞培養的pH值。通常推薦使用青霉素和鏈霉素等抗生素來(lái)降低污染的風(fēng)險。

2. 血清

我們應選擇一些既可以支持細胞培養，同時(shí)背景值又比較低的一些血清。并且血清本身不應引起非特異性的細胞活化或蛋白分泌。我們建議使用胎牛血清。血清批次間可能會(huì )有所不同，在ELISpot和FluoroSpot實(shí)驗前我們最好測試一下新的批次。我們一般推薦血清熱滅活。不推薦人血清，因為它可能含有能干擾檢測的異嗜性抗體或固有分析物。

3. 無(wú)血清培養基---消除血清中不確定成份的影響

 含替代血清成分從而提高細胞培養和實(shí)驗結果的重復性：

▲維持淋巴細胞存活，保持細胞活力和免疫功能狀態(tài)

▲不會(huì )額外刺激陰性細胞產(chǎn)生額外產(chǎn)生任何一種細胞因子

▲不會(huì )抑制陽(yáng)性細胞分泌各種因子

產(chǎn)品優(yōu)勢：

▲成分固定，徹底消除了批次間的差異。

▲不含雜蛋白，背景更弱，斑點(diǎn)更清晰。

▲不含抑制細胞因子分泌成分，斑點(diǎn)更多，更加反映真實(shí)的結果。

三、細胞稀釋指南

1. 活細胞計數

用臺盼藍或細胞計數儀檢測活細胞的數量。評估凋亡細胞的數量是一個(gè)優(yōu)勢。

2. 計算需要的細胞數

計算所需的細胞數量和所需的體積。建議制備過(guò)量的細胞懸浮液（10-20%），以確保有足夠的體積用于實(shí)驗。

3. 加入適量的培養基

將培養基加入到細胞懸浮液中。用于T細胞檢測的細胞濃度通常在0.5×106/ml和3×106/ml之間。

4. 混勻

充分混勻細胞懸液。

5. 將細胞懸浮液移到孔板中

在向孔板中加入細胞之前，應該先添加刺激物。另一種方法是將細胞和刺激物充分混勻后再加到孔板中。將細胞懸浮液移到孔板中。如果同時(shí)操作一個(gè)以上的孔板，應在加入細胞懸液前在重新混勻一下細胞懸液。一個(gè)孔板大約需要12ml。

建議稀釋的步驟:

四、細胞孵育

1. 細胞數

每個(gè)孔中細胞的數量必須與細胞類(lèi)型和細胞分泌的頻率相適應。如果頻率非常低，例如在10000個(gè)細胞中有1個(gè)，那么我們就需要更多數量的細胞，通常有250000個(gè)細胞/孔。當頻率較高時(shí)，例如在10個(gè)細胞中就有1個(gè)，那么我們僅需要大約5000個(gè)細胞/孔就足夠了。

2. 測定細胞線(xiàn)性度

在分析中，如果發(fā)現細胞沒(méi)有成線(xiàn)性關(guān)系，可能是由于細胞數量不夠，或者細胞刺激不夠造成的。比如當分析抗原特異性T細胞時(shí)，PBMC細胞數不應低于每孔200000個(gè)細胞。

3. 激活

在加入細胞之前，應將刺激物添加到孔板中，或者刺激物與細胞混勻后一起加入到孔板中。細胞被添加到孔板中后就不能再添加更多的培養基，因為后加入的培養基會(huì )使細胞向邊緣周?chē)鷶U散。在ELISPOT/FLUPOSBOT讀板前，應清洗細胞以避免膜的背景染色。在B細胞ELISPOT實(shí)驗中洗板是很重要的。

4. 動(dòng)力學(xué)

在建立適合細胞孵育時(shí)間時(shí)，應考慮蛋白質(zhì)分泌的動(dòng)力學(xué)因素。某些分析物僅在刺激超過(guò)24小時(shí)后才會(huì )分泌。

5. 濕度

我們要確保足夠的濕度來(lái)培養細胞。建議培養過(guò)程中用錫箔紙包裹孔板，避免蒸發(fā)。一般的建議，37°C ，5% CO2孵育細胞。

6. 靜置

避免細胞在培養過(guò)程中突然移動(dòng)，因為這將對斑點(diǎn)的形成產(chǎn)生不利的影響。

前三期詳情請參考：

ELISpot Part 1——ELISpot原理、優(yōu)勢及品牌推薦

ELISPOT Part 2-T細胞、B細胞ELISPOT介紹以及Mabtech相關(guān)產(chǎn)品

ELISpot Part 3——ELISpot的對照設置及不同的刺激物簡(jiǎn)介