某些真核動(dòng)物細胞,比如原代的T細胞,神經(jīng)細胞,和干細胞等,其特性決定了被廣泛使用的脂質(zhì)體轉染等化學(xué)試劑法必定不可能獲得可接受的轉染效果。而病毒轉染的繁瑣程序和潛在危害性又使得大規模應用病毒來(lái)解決這些細胞的轉染實(shí)驗成為實(shí)驗者不愿意選擇的路徑。
15年前Amaxa技術(shù)出現,改進(jìn)了古老的電轉技術(shù),針對真核細胞做了電擊波形和能量?jì)?yōu)化,又特別提出了保護細胞在電擊瞬間的保護液(轉染液)配方,從而大幅提高了這些原代真核細胞電轉的效率和存活率,由于電轉導致的DNA進(jìn)入細胞特別快,從而蛋白表達也可在幾個(gè)小時(shí)內觀(guān)察到,由此amaxa公司特別“制造”了一個(gè)詞“核轉染”來(lái)說(shuō)明這種技術(shù)的優(yōu)越之處。由此,Amaxa定義了第二代電轉技術(shù)。(Amaxa公司后來(lái)被Lonza公司收購,進(jìn)來(lái)逐漸被稱(chēng)為L(cháng)onza核轉染儀)
15年前,Amaxa技術(shù)是革命性改進(jìn),但是隨著(zhù)人們越來(lái)越多的使用amaxa電轉設備,還是逐漸暴露出其一些固有缺陷。
amaxa技術(shù)基于美國ATCC所謂“標準”細胞而設定,但實(shí)際上實(shí)驗室內使用的細胞都是本實(shí)驗室或者友好實(shí)驗室擴增傳代一代一代傳下來(lái)的,其和ATCC標準細胞早已千差萬(wàn)別。對于電轉這種在刀尖上跳舞:“增加一分則細胞電死,減少一分則細胞電不進(jìn)去”的原理,這種細胞性狀的細微差別就導致了電轉效果的巨大差別,這就是為什么大多數人反饋,達不到amaxa標準實(shí)驗Protocol上的電轉效果:別人明明是60%轉染效率,為什么我死活做出來(lái)就只有30%?
由于A(yíng)maxa設備是按照細胞類(lèi)型編碼轉染程序,而為了防止技術(shù)泄密,其采用了過(guò)度保護的措施,每個(gè)程序編碼代號完全是亂碼字母數字,導致用戶(hù)完全無(wú)法針對本實(shí)驗室細胞對amaxa程序進(jìn)行優(yōu)化調整。也就是說(shuō),一旦轉染效果不理想,排除其它因素以外,如果確認細胞不標準,Amaxa/Lonza的技術(shù)人員就只能建議你去買(mǎi)ATCC的標準細胞來(lái)滿(mǎn)足達到amaxa技術(shù)的效果。這是典型的“削足適履”,全球實(shí)驗者對此意見(jiàn)都非常的大。
Amaxa技術(shù)考慮到了電擊和化學(xué)保護試劑的問(wèn)題,但是在基本的電擊杯設計上依然保守了,采用了古老的狹縫U型電擊杯(第一代BioRad電擊技術(shù)采用的普通電擊杯)。這種電擊杯設計從電學(xué)物理原理上就必然會(huì )出現液面和貼壁區域大量細胞電死的問(wèn)題。由于電擊杯的電學(xué)物理特性是整個(gè)儀器電學(xué)設計的核心基礎,改進(jìn)電擊杯設計將導致整個(gè)機器系統都要重新設計,Amaxa設備已經(jīng)無(wú)法改變。更重要的是,其它電擊杯設計已經(jīng)被其它公司專(zhuān)利保護了,這包括我們下面提到的國產(chǎn)新第三代電轉設備的核心設計,amaxa技術(shù)已經(jīng)被阻擊,進(jìn)一步改進(jìn)升級的空間被堵死了。
Amaxa技術(shù)只有100ul和更小的20ul體系。100ul體系一次電轉也就是10^6級,這和脂質(zhì)體/病毒轉染可適應10^6-10^9不可同日而語(yǔ)。這也是很多人為什么不選擇電轉路徑的重要原因之一。由于A(yíng)maxa已經(jīng)選擇了狹縫U型電擊杯的路線(xiàn),這導致其無(wú)法加大細胞轉染量這一難題。近兩年Amaxa/Lonza公司推出了可一次做10^7-10^8轉染的新機器,但是基本原理依然基于100ul電轉反應體系,無(wú)非是采用了復雜的流體系統,通過(guò)多次自動(dòng)連續進(jìn)樣,從而把一個(gè)本來(lái)一次可以完成的1ml或者10ml轉染分成了連續的10次或者100次轉染而已??梢钥吹竭@種錯誤技術(shù)路線(xiàn)導致這種解決方案的機器構造復雜而價(jià)格昂貴,而耗材成本更是天價(jià):一兩萬(wàn)人民幣耗材做一個(gè)108細胞的轉染,你能接受嗎?
現在,在電轉這一細分的細胞生物學(xué)高科技領(lǐng)域,中國人的科研力量已經(jīng)出現!已經(jīng)落地實(shí)現商業(yè)化。已經(jīng)加入激烈的市場(chǎng)競爭,正面挑戰amaxa技術(shù)!已經(jīng)在美國和中國多個(gè)重要科研院所(都是具有多臺amaxa設備,多年amaxa使用經(jīng)驗的實(shí)驗室)得以驗證,成功改寫(xiě)了用戶(hù)的看法,實(shí)現了商業(yè)市場(chǎng)競爭的勝利。
Celetrix電轉儀,有幾大核心技術(shù)突破。
第一,重要的核心創(chuàng )新:加壓電擊管替代傳統U型電擊杯的設計。
加壓電擊管看起來(lái)和生物學(xué)實(shí)驗中使用很多的凍存管樣子類(lèi)似,可是把它變成電擊管,卻從來(lái)沒(méi)有人想到。這種利用封閉電化學(xué)效應的獨特創(chuàng )新使得真核細胞受到電擊的瞬態(tài)極為穩定可靠,是基本原理的革新,從根源上解決了老式的電極杯和毛細管內電場(chǎng)不均勻的問(wèn)題。從而奠定了它具有更高電轉效率和更高細胞存活率的基礎原理的優(yōu)越性。從實(shí)踐看來(lái),加壓電擊管在瞬間大電壓產(chǎn)生電轉效應后,極少觀(guān)測到細胞死亡的“白沫”,充分說(shuō)明了其核心理論的正確性,為進(jìn)一步改進(jìn)和發(fā)展這一新時(shí)代的電轉技術(shù)提供了基本物理基礎。目前這一電擊管設計已經(jīng)申請了美國和中國專(zhuān)利,從而堵死了amaxa技術(shù)進(jìn)一步改進(jìn)的空間。
第二,可以通過(guò)簡(jiǎn)單擴大加壓電擊管的容積來(lái)實(shí)現大容量細胞電轉。
這種電擊管的新一代設計提供了一種可能,只要獲得大能量電流的控制能力,理論上就可以通過(guò)簡(jiǎn)單增大電擊管的容積來(lái)實(shí)現一次性的大容量細胞電轉。目前Celetrix已經(jīng)可以提供一次性電擊1ml (約10^8細胞)的設備,無(wú)論從結果的可靠性(一次電轉,而不是10次100ul電轉相加),簡(jiǎn)單易用,耗材成本大幅度降低等角度,這都是未來(lái)大容量細胞電轉的必然發(fā)展趨勢。
第三,針對Amaxa技術(shù)的缺陷,使得用戶(hù)自調節電轉參數稱(chēng)為簡(jiǎn)單易用的事情。
用戶(hù)簡(jiǎn)單調節一兩個(gè)數值,就可以微調細胞電轉條件,從而獲得真正的“自己實(shí)驗室的細胞”的適合電轉條件,而不是這一類(lèi)(比如:Amaxa設備上 人T細胞類(lèi) 的固定程序,固定電轉參數)的參數,從而能得到符合當前實(shí)驗室細胞情況的結果。
第四,針對Amaxa技術(shù)非常高昂的試劑耗材價(jià)格,Celetrix大幅降低了日常使用成本,只有Amaxa同等條件(100ul體系)的約50-60%價(jià)格。如果用戶(hù)電轉更多容量,Celetrix提供200ul一次,和1ml一次的容量,那節約的試劑耗材就更是只有幾分之一甚至十分之一了。這就是核心技術(shù)改進(jìn)帶來(lái)的成本優(yōu)勢。
目前,Celetrix剛剛面試不到兩年,但已有美國耶魯大學(xué),哈佛大學(xué),NIH;也有中國國內的中科院,北京大學(xué),等近百家實(shí)驗室使用,這些使用者都是原Amaxa技術(shù)的重度使用者,非常了解兩者之間的區別,他們的選擇不僅僅是對中國技術(shù)和產(chǎn)品的信任,根源還是對第三代電轉技術(shù)(如果說(shuō)Amaxa技術(shù)是第二代電轉技術(shù))優(yōu)越性的認可。
達科為生物作為Celetrix產(chǎn)品在中國的總代理商,歡迎使用過(guò)Amaxa產(chǎn)品的科研人員來(lái)電來(lái)信咨詢(xún)和進(jìn)行對比測試。我們愿為這一優(yōu)秀民族工業(yè)產(chǎn)品和世界性的創(chuàng )新產(chǎn)品提供力所能及的支持和服務(wù)。