InvivoGen春季刊——RIG-I與STING的聯(lián)盟

InvivoGen提供多種RIG-I和STING相關(guān)產(chǎn)品

RIG-I信號通路

RIG-I配體

? 5’ppp-dsRNA

5’ppp-dsRNA是一種5’三磷酸雙鏈RNA，通過(guò)一個(gè)由19個(gè)核酸分子通過(guò)磷酸二酯鍵聚合成的5’三磷酸單鏈RNA和其非三磷酸互補鏈雜交形成。5’ppp-dsRNA的序列可以通過(guò)篩選各種序列突變體確定。未加帽的5’三磷酸雙鏈RNA能夠被RIG-I特異性識別。

? 3p-hpRNA

3p-hpRNA是通過(guò)體外轉錄甲型流感病毒（H1N1）序列而產(chǎn)生的5’三磷酸發(fā)夾RNA。這個(gè)有87個(gè)核酸分子的RNA寡核苷酸含有未加帽的5`三磷酸酯末端和雙鏈片段，它們是RIG-I識別的特征結構。3p-hpRNA是RIG-I的一種有效并特異性的激動(dòng)劑。

RIG-I/MAVS 報告基因細胞

InvivoGen提供一系基于人源肺癌細胞株A549，小鼠巨噬細胞RAW和人源胚腎細胞HEK293穩轉細胞系，助力RNA感受器RIG-I信號通路的研究。這些細胞系包括RIG-I或MAVS基因的敲除細胞株（衍生自A549或RAW細胞系）或者RIG-I基因的過(guò)表達細胞株（衍生自HEK-293細胞系）。

? A549-Dual?

? A549-Dual? KO-RIG-I 

? A549-Dual? KO-MAVS

? HEK-Lucia? Null

? HEK-Lucia? RIG-I

? RAW-Lucia? ISG

? RAW-Lucia? ISG KO-RIG-I

? RAW-Lucia? ISG KO-MAVS

描述

所有的RIG-I/MAVS報告基因細胞系均表達一個(gè)含有分泌型熒光素酶基因ISG（干擾素刺激基因）誘導型構件?；罨疪IG-I/MAVS信號通路可誘導ISG啟動(dòng)子的活化并產(chǎn)生熒光素酶，該酶存在于細胞上清并能夠通過(guò)熒光素酶檢測試劑QUANTI-Luc?檢測定量。源于A(yíng)549的細胞攜帶一個(gè)額外的NF-κB誘導表達分泌型堿性磷酸酶（SEAP）基因構件，該酶的活性能夠通過(guò)SEAP檢測試劑QUANTI-Blue?檢測定量。

這些RIG-I/MAVS報告基因細胞株攜帶Zeocin?單抗性基因或Zeocin?和Blasticidin（參見(jiàn)最后一頁(yè)）雙抗性基因。

結果

使用RIG-I激動(dòng)劑，復合了LyoVec?的5’ppp-dsRNA和3p-hpRNA刺激A549-Dual?和RAW-Lucia? ISG細胞系，ISG應答顯著(zhù)。在A(yíng)549-Dual?細胞中3p-hpRNA激動(dòng)性強度明顯高于5’ppp-dsRNA，30 ng/ml的3p-hpRNA復合物活化信號已明顯高于300 ng/ml 5’ppp-dsRNA的復合物。相反，在RIG-I-KO或MAVS-KO細胞株中應答消失。使用RIG-I配體刺激HEK-Lucia?對照細胞時(shí)ISG反應很弱。而在HEK-Lucia? RIG-I細胞中，由于RIG-I基因的組成型過(guò)表達導致這種應答尤為強烈。同樣，當使用3p-hpRNA和5’ppp-dsRNA時(shí)觀(guān)察到更高水平的ISG應答。在衍生自A549的細胞株中NF-κB對于RIG-I配體的反應跟ISG應答是相似的，雖然前者更弱一些（參考網(wǎng)站數據）。

ISG對RIG-I配體的反應：使用300 ng/ml的5’ppp-dsRNA或30 ng/ml的3p-hpRNA刺激衍生自A549的細胞；使用1 μg/ml 5’ppp-dsRNA或3p-hpRNA刺激衍生自RAW和HEK293的細胞。經(jīng)過(guò)孵育過(guò)夜，可使用QUANTI-Luc?檢測上清中Lucia熒光素酶活性的相對光單位（RLUs）以測試ISG的反應。

相關(guān)產(chǎn)品

l STING突變株

STING SAVI報告基因細胞株

InvivoGen提供給一系列基于人源THP1單核細胞系的STING突變體的報告基因細胞株。其中，有兩款表達STING- associated vasculopathy with onset in infancy（SAVI）的功能獲得性突變體(S154 and M155)。SAVI患者在STING蛋白中顯示出單一突變，導致其持續激活和ISG的過(guò)度活化。S154是新生突變[1]，M155是遺傳突變[2]。STING SAVI報告基因細胞株是篩選STING通路抑制劑便捷有力的工具。

? THP1-Dual? KI-hSTING-S154     ? THP1-Dual? KI-hSTING-M155

描述

THP1-Dual? KI-hSTING-S154細胞和THP1-Dual? KI-hSTING-M155細胞均來(lái)自THP1-Dual? KO-STING細胞，該細胞衍生自THP-1細胞，穩定敲除了內源性人源STING的雙等位基因并穩定整合了兩種可誘導分泌的報道基因（Lucia螢光素酶和SEAP（分泌型胚胎堿性磷酸酶）。THP1-Dual? KO-STING細胞敲入了“野生型”R232人源STING突變體[3]的無(wú)內含子編碼序列和一個(gè)S154 或M155突變位點(diǎn)。IRF3和NF-κB通路能夠通過(guò)分別測試Lucia熒光素酶或SEAP活性進(jìn)行檢測。細胞培養上清中的報告基因蛋白活性能夠使用QUANTI-Luc? and QUANTI-Blue?檢測試劑進(jìn)行檢測。SAVI報告基因細胞對Blasticidin和Zeocin?有抗性。

結果

功能獲得(Gain-of-function)的活化-THP1-Dual? KI-hSTING-S154細胞和THP1-Dual? KI-hSTING-M155細胞均均可以持續活化ISG，而THP-1-Dual? KI-hSTING-R232卻不能。加入IFN-β或STING激動(dòng)劑將進(jìn)一步促進(jìn)ISG的活化。注意，結果已被非刺激細胞背景信號標準化。因為其持續活化STING的特性，SAVI細胞的背景非常高，誘導ISG應答的增加倍數低于R232對照細胞。
       抑制劑功能-加入TBK-1抑制劑BX795，或Brefeldin A，一種抑制蛋白從ER轉運到高爾基體的蛋白轉運抑制劑，能夠顯著(zhù)抑制SAVI細胞中STING信號的轉導。所以，這些細胞能夠用于篩選STING的抑制劑。

1. Munoz J. et al., 2015. Stimulator of interferon genes-associated vasculopathy with onset in infancy: a mimic of childhood granulomatosis with polyangiitis. JAMA Dermatology 151: 872-7.

2. Jeremiah N. et al., 2014. Inherited STING-activating mutation underlies a familial inflammatory syndrome with lupus-like manifestations. The Journal of Clinical Investigation 124: 5516-20.

3. Yi G. et al., 2013. Single nucleotide polymorphisms of human STING can affect innate immune response to cyclic dinucleotides. PLOS ONE 8: e77846。

對IFN-β或STING激動(dòng)劑的ISG應答：使用104 U/ml IFN-β, 10 μg/ml 2’3’ cGAMP或2’3’ cGAMP(PS)2(Rp/Sp), 30 μM BX795 or 10 μg/ml Brefeldin A刺激衍生自THP1-Dual?細胞。孵育過(guò)夜后，通過(guò)使用QUANTI-Luc?檢測上清中Lucia熒光素酶活性測試ISG應答。Bar值表示非刺激細胞中背景信號標準化的活性百分比。

相關(guān)產(chǎn)品

STING 篩選服務(wù)

InvivoGen提供一系列STING篩選服務(wù)的選擇，用于鑒定激活或抑制一些STING突變體的分子。欲知更多信息請聯(lián)系我們。

重組人源STING蛋白

STING通過(guò)胞漿區域與CDNs結合。InvivoGen提供的重組STING蛋白對應可溶性的胞漿結構域（aa 137-379）R232突變型，是普遍的人源STING蛋白的同型。這個(gè)27kDa的重組蛋白產(chǎn)生自哺乳動(dòng)物中國倉鼠卵巢細胞系（CHO），通過(guò)親和層析純化，不帶標簽，能夠被市面上的商品化人源STING抗體所識別。

l 基因篩選抗生素

細胞培養測試的抗生素

? 無(wú)菌

? 無(wú)內毒素

? 驗證篩選功能

InvivoGen提供一系列細胞培養測試的抗生素以確保無(wú)假陰性篩選穩轉哺乳動(dòng)物細胞株。這些抗生素無(wú)菌且無(wú)內毒素污染以避免細菌內毒素，也被稱(chēng)為L(cháng)PS，對轉染細胞造成的有害影響。InvivoGen嚴格驗證產(chǎn)品的物理化學(xué)，通過(guò)微生物和細胞培養以確保其功能活性。所有出品的抗生素被證實(shí)對哺乳動(dòng)物細胞表現出長(cháng)期的穩定性并且沒(méi)有細胞毒性。

InvivoGen的篩選抗生素可與其他篩選抗生素或與細胞培養過(guò)程中預防支原體，細菌，真菌污染的抗微生物抗生素聯(lián)合使用。有不同的規格可供選擇。

相關(guān)產(chǎn)品

InvivoGen 1977年成立于法國，是法國較早的生物科技公司。公司成立的初期階段主要提供細胞培養相關(guān)試劑，如抗支原體、細菌、真菌污染的抗生素以及基因篩選抗生素（Blasticidin, Puromycin, Hygromycin B, G418, Zeocin）。隨著(zhù)天然免疫研究熱點(diǎn)的興起，InvivoGen于2000年開(kāi)始致力于天然免疫相關(guān)產(chǎn)品的研發(fā)和生產(chǎn)，并成為全世界優(yōu)質(zhì)、專(zhuān)業(yè)的天然免疫相關(guān)產(chǎn)品生產(chǎn)商。InvivoGen為天然免疫研究提供一整套研究方案，包括不斷更新的模式識別受體（PRRs）激動(dòng)劑和拮抗劑，PRRs報告基因細胞以及天然免疫信號通路的誘導劑和抑制劑等。